曹 丁，黃魁英，林創(chuàng)偉，夏楓耿，張高賢，張玲華

(1.廣州市微生物研究所，廣東廣州510663;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642)

抗菌肽又稱抗微生物肽，是指廣泛存在于生物體內(nèi)，能夠抵抗外界病原菌侵害，具有多種免疫活性的先天性防御小分子多肽類物質(zhì)［1］。近年來(lái)由于濫用抗生素引發(fā)耐藥性菌株增加，又因禽畜制品的抗生素殘留問(wèn)題嚴(yán)重危害人類健康，而抗菌肽由于特殊的抑菌機(jī)理不易耐藥，抗菌譜廣，使用安全性高，有望作為抗生素的替代品［2－3］。研究者將抗菌肽基因克隆于酵母中進(jìn)行表達(dá)，生產(chǎn)抗菌肽酵母制劑，用作畜禽及水產(chǎn)飼料添加劑，預(yù)防及治療動(dòng)物疫?。?］。然而用酵母表達(dá)的抗菌肽不穩(wěn)定且效價(jià)偏低，自身耐受性差，易被蛋白酶降解，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本偏高，不易進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，限制了其生產(chǎn)應(yīng)用［5］。

1985年，Bulla等［6］報(bào)道芽孢桿菌能產(chǎn)生多肽類的抗生素，這些抗菌肽包括Lleines、Bacitracins及Gramieidins等，它們都具有線狀或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分子量小，熱穩(wěn)定性好，含有D－氨基酸，能耐受蛋白酶的水解作用。目前，有關(guān)芽孢桿菌分泌的抗菌肽研究主要用于植物病害的防治，而用于防治人類、動(dòng)物疾病的研究較少［7］。然而此類抗菌肽由于來(lái)源可靠，表達(dá)穩(wěn)定，無(wú)污染，低成本，具有廣闊的應(yīng)用前景。但多數(shù)芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽組分較少，抗菌譜相對(duì)較窄，且產(chǎn)量較低，無(wú)法規(guī)模生產(chǎn)［8］。面對(duì)巨大的市場(chǎng)需求，開發(fā)高產(chǎn)量活性的抗菌肽芽孢桿菌制劑迫在眉睫。

該研究的抗菌肽是來(lái)源于一株枯草芽孢桿菌工程菌GL08，菌株綠色安全，無(wú)需誘導(dǎo)，可穩(wěn)定表達(dá)多種抗菌肽組分，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝后以提高效價(jià)，降低成本，從而實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)?？咕模挎邨U菌制劑的研制成功將成為代替抗生素的新型飼料添加劑或生物肥料，具有較高的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試菌 產(chǎn)抗菌肽的枯草芽孢桿菌GL08和大腸桿菌K12D31由廣州市微生物研究所提供。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，酵母抽提物20 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH 7.0，固體培養(yǎng)基加20 g/L的瓊脂粉。初始發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨20 g/L，酵母抽提物10 g/L，氯化鈉 10 g/L，磷酸二氫鉀 0.8 g/L，七水合硫酸鎂 0.2 g/L，碳酸鈣 4 g/L，pH 6.7。效價(jià)檢測(cè)用培養(yǎng)基:NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，葡萄糖 5 g/L，瓊脂粉 20 g/L，pH 7.0。

酵母抽提物、胰蛋白胨:英國(guó) Oxoid公司;瓊脂粉:廣州環(huán)凱生物科技有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器設(shè)備 生化培養(yǎng)箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DHZ－DA大容量全溫振蕩器:太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;752N型紫外可見分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;50 L、500 L不銹鋼發(fā)酵罐:上海洋格生物設(shè)備有限公司。

1.4 GL08菌株搖瓶發(fā)酵 將斜面保存的GL08菌株接種于種子培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，然后以1%的接種量接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程分別取樣監(jiān)測(cè)各種生理指標(biāo)。

1.5 GL08菌株的500 L發(fā)酵罐中試試驗(yàn) 將GL08菌種接種于種子培養(yǎng)基中，置于30℃、150 r/min培養(yǎng)20～24 h，待菌體長(zhǎng)至穩(wěn)定期后再接種于50 L種子罐，同樣30℃培養(yǎng)8～9 h后，待菌體長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期時(shí)，過(guò)種到500 L發(fā)酵罐，每隔2 h取樣檢測(cè)發(fā)酵液的各項(xiàng)參數(shù)。

1.6 GL08菌株發(fā)酵過(guò)程各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 菌體生物量測(cè)定。根據(jù)發(fā)酵液活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值和吸光度成一定的線性關(guān)系原理，通過(guò)測(cè)定其在570 nm下的吸光度來(lái)間接反映菌體的生長(zhǎng)情況。

1.6.2 pH測(cè)定。用PHS-25數(shù)顯酸度計(jì)測(cè)定。

1.6.3 還原糖測(cè)定。用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定。

1.6.4 殺菌效價(jià)測(cè)定。參照文獻(xiàn)［9］的方法，采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂孔穴擴(kuò)散法，以大腸桿菌K12D31為指示菌，制備效價(jià)平板。然后用打孔器(直徑2.7 mm)打孔，每孔分別加入5 μl GL08菌株發(fā)酵上清，共3個(gè)平行板，每個(gè)平板重復(fù)3次，同時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)樣(標(biāo)定為1萬(wàn)效價(jià))對(duì)照，37℃培養(yǎng)14～16 h后，測(cè)定抑菌圈直徑。用此公式計(jì)算殺菌效價(jià):殺菌效價(jià)(IU/ml)=2X×1 000 ×稀釋倍數(shù)，X=(抑菌直徑 －2.7)/2.1，樣品殺菌效價(jià)校正值=樣品殺菌效價(jià)實(shí)測(cè)值*10 000/標(biāo)準(zhǔn)品殺菌效價(jià)實(shí)測(cè)值。為減小不同測(cè)量批次之間的誤差，該研究中樣品的效價(jià)均為校正值。

2 結(jié)果與分析

2.1 GL08菌株搖瓶最佳發(fā)酵時(shí)間的確定 將GL08菌株接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于不同時(shí)間取樣檢測(cè)發(fā)酵上清的抑菌效價(jià)，結(jié)果見表1。

表1 GL08菌株在初始培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)時(shí)間的效價(jià)

由表1可知，GL08菌株在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h效價(jià)達(dá)到最高，之后逐漸下降，因此選擇24 h為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的終點(diǎn)。

2.2 GL08菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 最佳碳源。分別用20 g/L的可溶性淀粉、麥芽糊精、甘油、蔗糖、果糖和乳糖作為單一碳源替代初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，其余配方同初始發(fā)酵培養(yǎng)基，按“1.4”的方法接種培養(yǎng)，并取樣檢測(cè)效價(jià)等各指標(biāo)，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，GL08菌株在蔗糖作為單一碳源的培養(yǎng)基中，抑菌效價(jià)最高(8 421 IU/ml)，考慮到葡萄糖作為速效碳源能迅速啟動(dòng)菌體生長(zhǎng)，為縮短發(fā)酵周期，故選擇葡萄糖與蔗糖搭配使用作為復(fù)合碳源。

2.2.2 最佳氮源。在篩選出合適碳源的基礎(chǔ)上，分別用30 g/L的國(guó)產(chǎn)蛋白胨、國(guó)產(chǎn)酵母浸膏、牛肉膏、黃豆餅粉、硫酸銨和干酪素分別替代初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的進(jìn)口蛋白胨和酵母抽提物作為單一氮源，其他成分相同，在搖瓶水平進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)，并取樣檢測(cè)效價(jià)等各指標(biāo)，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，GL08在不同氮源中的抑菌效價(jià)差異很大，在無(wú)機(jī)氮源硫酸銨中長(zhǎng)勢(shì)較差，效價(jià)也低，說(shuō)明硫酸銨單獨(dú)使用并不能滿足菌體生長(zhǎng)和合成產(chǎn)物的需求。在國(guó)產(chǎn)酵母膏中的效價(jià)最高(9 468 IU/ml)，黃豆餅粉和初始培養(yǎng)基次之(分別為8 622和8 468 IU/ml)，但在黃豆餅粉中菌體長(zhǎng)勢(shì)最好，考慮到國(guó)產(chǎn)酵母膏和黃豆餅粉價(jià)廉易得，因此選擇國(guó)產(chǎn)酵母膏和黃豆餅粉作為氮源搭配使用。

2.2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化碳源和氮源的最佳配比。在單因素試驗(yàn)確定了GL08菌株合適的碳源和氮源后，由于不同碳氮源之間具有交互作用，因此用4因素3水平正交表，以殺菌效價(jià)為指標(biāo)用來(lái)確定不同碳氮源之間的最佳配比，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2，每組發(fā)酵培養(yǎng)24 h后取樣檢測(cè)抑菌活性。

表2 正交試驗(yàn)的因素水平 g/L

由表3可知，在GL08菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮源中，對(duì)發(fā)酵上清殺菌效價(jià)的影響排序?yàn)閲?guó)產(chǎn)酵母膏、葡萄糖、黃豆餅粉、蔗糖，即國(guó)產(chǎn)酵母膏的含量對(duì)抗菌肽產(chǎn)量影響最大，葡萄糖次之，從而得出優(yōu)化的最佳配方是葡萄糖30 g/L，蔗糖20 g/L，國(guó)產(chǎn)酵母膏30 g/L，黃豆餅粉10 g/L，理論預(yù)測(cè)效價(jià)為14 518 IU/ml。在搖瓶中對(duì)優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)得殺菌效價(jià)為14 023 IU/ml，與理論預(yù)測(cè)值接近，比正交試驗(yàn)效價(jià)最高的第8組略高。

2.2.4 最佳發(fā)酵配方的中試驗(yàn)證及GL08菌株的生長(zhǎng)特性。按照優(yōu)化后GL08菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，將GL08搖瓶種子于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，按3%的接種量接種于50 L種子罐中，經(jīng)過(guò)二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，在500 L的發(fā)酵罐中以同樣的工藝條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并用初始發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照，驗(yàn)證優(yōu)化培養(yǎng)基的發(fā)酵水平。GL08菌株在500 L發(fā)酵罐中，從接種開始，每隔1～2 h取樣測(cè)定發(fā)酵液的pH、OD570、抑菌效價(jià)和還原糖含量，結(jié)果見圖3、4。

表3 GL08發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)結(jié)果

從圖3可以看出，GL08菌株在500 L發(fā)酵罐的初始培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)短暫的延滯期，從第2 h起開始生長(zhǎng)，可能是因?yàn)榻臃N量大，且發(fā)酵培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分接近。2～8 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，到8 h后經(jīng)過(guò)短暫的穩(wěn)定期后，迅速進(jìn)入衰亡期，OD570值下降趨勢(shì)明顯。殺菌效價(jià)的變化趨勢(shì)與菌體生物量的變化趨勢(shì)大體一致，隨著菌體的生長(zhǎng)，抗菌肽逐步產(chǎn)生，在發(fā)酵過(guò)程中，抗菌肽的產(chǎn)生量與生物量呈正相關(guān)，到8 h菌體的生物量達(dá)到最大(OD570=12.16)，抗菌肽的效價(jià)也達(dá)到最大為8 035 IU/ml，從第9 h起，菌體開始衰亡自溶，OD570值迅速下降，抗菌肽的效價(jià)也隨之下降。pH在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，剛開始隨菌體生長(zhǎng)而有所下降，從9 h起一直到發(fā)酵結(jié)束，pH開始逐步上升。說(shuō)明發(fā)酵液pH上升，效價(jià)和OD570下降的時(shí)間點(diǎn)是一致的，此時(shí)間點(diǎn)即為放罐的最佳時(shí)間。

從圖4可以看出，GL08菌株在500 L發(fā)酵罐的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中，從第4 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8 h OD570達(dá)到最高，之后開始緩慢下降，菌體進(jìn)入衰亡期。在發(fā)酵初期，發(fā)酵液的殺菌效價(jià)隨著菌體的生長(zhǎng)緩慢增長(zhǎng)，8～14 h效價(jià)高速增長(zhǎng)，到14 h達(dá)到最高，之后保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。GL08菌株在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中pH維持在5～6，變化趨勢(shì)不明顯。由此可知，GL08菌株是在穩(wěn)定期大量產(chǎn)生抗菌肽，OD570達(dá)到最高點(diǎn)約6 h后，效價(jià)達(dá)到最高為15 311 IU/ml，之后相對(duì)穩(wěn)定，此時(shí)可以結(jié)束培養(yǎng)。

由此可知，GL08菌株在優(yōu)化培養(yǎng)基中，效價(jià)大幅提高。在相同培養(yǎng)基中500 L發(fā)酵罐的菌體生物量和效價(jià)都比搖瓶有所提高，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵罐的通風(fēng)和攪拌更利于物質(zhì)傳遞，產(chǎn)生更高的溶氧，更有利于菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成。在500 L發(fā)酵罐中，抗菌肽在初始培養(yǎng)基中效價(jià)為8 035 IU/ml，在優(yōu)化培養(yǎng)基中的效價(jià)為15 311 IU/ml，與初始培養(yǎng)基相比，優(yōu)化后的培養(yǎng)基效價(jià)提高約90%，且抗菌肽在發(fā)酵后期的穩(wěn)定性也得到提高。

3 結(jié)論與討論

該研究以枯草芽孢桿菌GL08為研究對(duì)象，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了高效表達(dá)抗菌肽的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖30 g/L，蔗糖20 g/L，國(guó)產(chǎn)酵母膏30 g/L，黃豆餅粉10 g/L，氯化鈉10 g/L，磷酸二氫鉀0.8 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，碳酸鈣4 g/L，優(yōu)化后搖瓶的殺菌效價(jià)為14 023 IU/ml，比優(yōu)化前提高了一倍。并在500 L中試規(guī)模水平上對(duì)優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了驗(yàn)證，通過(guò)觀察比較GL08菌株在初始培養(yǎng)基和優(yōu)化后培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性，發(fā)現(xiàn)抗菌肽在優(yōu)化培養(yǎng)基中的效價(jià)為15 311 IU/ml，與初始培養(yǎng)基效價(jià)8 035 IU/ml相比提高約90%。此外，優(yōu)化后的培養(yǎng)基用廉價(jià)易得的國(guó)產(chǎn)組分代替昂貴的進(jìn)口成分，使生產(chǎn)成本大大降低，且抗菌肽在發(fā)酵后期的穩(wěn)定性也得到提高。

綜上所述，該生產(chǎn)工藝調(diào)控簡(jiǎn)單，成本低，發(fā)酵周期短，且表達(dá)穩(wěn)定，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。該研究在500 L中試水平進(jìn)行了多次發(fā)酵試驗(yàn)，研究了GL08菌株分泌表達(dá)抗菌肽的各項(xiàng)指標(biāo)，初步掌握了其生長(zhǎng)特性，為后期進(jìn)一步研究抗菌肽的中試調(diào)控工藝提供了參考，并為抗菌肽的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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