穆曉琨,李充璧,高飛云,王 玨(肇慶學(xué)院生物醫(yī)藥工程中心,廣東肇慶526061)
柑橘是世界第一大水果,主要分布在35°N以南的區(qū)域,性喜溫暖濕潤(rùn),有大水體增溫的地域可向北推至45°N。世界上有135個(gè)國(guó)家生產(chǎn)柑橘,年產(chǎn)量10 282.2萬(wàn)t,面積715.3萬(wàn) hm2,均居百果之首,產(chǎn)量第 1位的是巴西,為2 425.26萬(wàn) t,第2 位美國(guó),為1 633.52 萬(wàn)t,中國(guó)第3,為1 078萬(wàn) t,再后是墨西哥、西班牙、伊朗、印度、意大利等國(guó)[1]。
柑橘黃龍病是一種世界范圍內(nèi)的柑橘毀滅性病害,該病最早在我國(guó)被發(fā)現(xiàn)后的近100年間,已廣泛分布于亞洲、非洲和美洲等地的國(guó)家和地區(qū)。黃龍病能侵染各種柑橘類植物,病樹(shù)主要表現(xiàn)為經(jīng)濟(jì)壽命短,產(chǎn)量低,果品質(zhì)劣,引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失。柑橘樹(shù)的經(jīng)濟(jì)壽命原來(lái)可達(dá)幾十年,乃至上百年,但受黃龍病危害之后,柑橘樹(shù)的壽命大大縮短,僅有10年左右。黃龍病曾給東南亞以及我國(guó)的廣東、廣西和福建3省區(qū)的柑橘產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重影響,近年來(lái)該病害又有卷土重來(lái)之勢(shì)[2]。
黃龍病的病原物尚不能人工培養(yǎng),目前普遍認(rèn)為原核生物薄壁菌門變形菌綱(Proteobacteria)α-變型菌綱(Alphaproteobaeteriacea)根瘤菌目(Rhizobiales)α-根瘤菌科(Rhizobiaceae)韌皮部桿菌屬(Candidatus Libefibaeter)是引起黃龍病的主要病原。柑橘黃龍病無(wú)特效抑制劑,也沒(méi)有抗(耐)病品種可供應(yīng)用。因此,只有通過(guò)嚴(yán)格地進(jìn)行檢疫措施、使用無(wú)病苗木、及時(shí)挖除病樹(shù),以及系統(tǒng)、全面地防治木虱是目前防治黃龍病最有效的方法[3]。
16S rDNA是原核生物分類中最常用和最有效的方法[4]。16S rDNA序列具有高度保守性,可以用來(lái)精確鑒定原核生物之間的親緣關(guān)系,其所蘊(yùn)含的信息能反映生物界的進(jìn)化關(guān)系[5]。通過(guò)比較其所特有的16S rDNA序列間的同源性差異程度可以判斷種屬及親緣關(guān)系,在原核生物的鑒定和分析方面具有重要地位[6]。
為了更好地對(duì)黃龍病病原及其分化進(jìn)行研究,筆者運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)從我國(guó)廣東省肇慶地區(qū)高要、四會(huì)、廣寧、封開(kāi)、懷集5個(gè)市縣采集的40多個(gè)黃龍病感染柑橘樣品進(jìn)行了菌種的分離、純化和保存,然后對(duì)其16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆和DNA測(cè)序,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
1.1 材料 柑橘黃龍病植株內(nèi)生菌來(lái)自肇慶地區(qū),實(shí)驗(yàn)室分離??寺∮么竽c桿菌菌種E.coli TGI、質(zhì)粒由肇慶學(xué)院生物醫(yī)藥工程中心保存;克隆載體pMD18-T Vector購(gòu)自TaKa-Ra公司。
1.2 方法
1.2.1 柑橘內(nèi)生菌分離。①?gòu)膽褜?、廣寧等地的柑橘果園,取回?zé)o病植株和有病植株的枝葉及土壤,按照常規(guī)細(xì)菌分離方法進(jìn)行內(nèi)生菌分離。②細(xì)菌培養(yǎng)。將取自患有黃龍病的柑橘枝、葉部分分離出的病原細(xì)菌接入到含有LB培養(yǎng)液的試管中活化、恒溫振蕩培養(yǎng)。
1.2.2 16S rDNA克隆。①細(xì)菌DNA提取。將來(lái)源肇慶不同地區(qū)的柑橘內(nèi)生菌基因組DNA進(jìn)行提取,按照北京天根生化科技有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟進(jìn)行。②DNA定量。空白對(duì)照為250 μl ddH2O,吸取樣本1 μl加入250 μl ddH2O在紫外分光計(jì)上測(cè)定A260和A280,可得到DNA濃度,進(jìn)而粗略估計(jì)樣品純度。③PCR擴(kuò)增16S rDNA。設(shè)計(jì)細(xì)菌的通用PCR引物27F:5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3';1429R:5'TAGGGTTACCTTGTTACGACTT 3'。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,4℃ 保存。以從肇慶周邊各區(qū)縣疑似患有黃龍病的柑橘枝和葉中所分離出的內(nèi)生菌16S rDNA為模板,用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。④電泳檢測(cè)16S rDNA片段。⑤目的基因克隆。將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體16℃下連接過(guò)夜后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,涂布于含Amp、X-gal和IPTG的LB平板上,37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑選白色菌落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。
1.2.3 基因序列測(cè)定。菌液PCR鑒定后,將篩選的陽(yáng)性單菌落送至南方基因組中心測(cè)序。
2.1 16S rDNA片段分離 從柑橘黃龍病植株中分離出內(nèi)生真菌40株,細(xì)菌20株。從細(xì)菌中提取出DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果擴(kuò)增出1 261 nt的16S rDNA片段(圖1)。
2.2 序列分析 經(jīng)序列測(cè)定發(fā)現(xiàn),從不同地區(qū)柑橘黃龍病植株中分離到的內(nèi)生菌在健康株中也存在1 261 nt的16S rDNA片段。通過(guò)序列分析,可以推測(cè)該內(nèi)生菌與眾多的未能培養(yǎng)的細(xì)菌(Uncultured bacterium)都有極高的相似度,其中的測(cè)序結(jié)果在同源性檢測(cè)中,與其相似度最高的是Uncultured bacterium clone yf5-180,達(dá)到91.3%。說(shuō)明此序列是一個(gè)較新的序列,是一種與已知細(xì)菌種類不同的細(xì)菌,因?yàn)槟壳吧形匆?jiàn)柑橘黃龍病病原分離培養(yǎng)的報(bào)道,也沒(méi)有明確確定柑橘黃龍病的病原菌是何種細(xì)菌,此種細(xì)菌極有可能就是柑橘黃龍病的致病菌。序列測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。
序列分析可知,在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性對(duì)比中,同源性達(dá)到90.5% ~91.3%是未能夠培養(yǎng)的細(xì)菌 Uncultered candidated bacterGS242.seq 和 Uncultured bacterium clone yf5-180 16S ribosomal RNA gene,同源性相差3%,即可認(rèn)為是不同種(表1)。
表1 核苷酸序列同源性分析
2.3 進(jìn)化樹(shù)分析 分子進(jìn)化樹(shù)分析表明,該內(nèi)生菌的16S rDNA親緣關(guān)系與未能培養(yǎng)的細(xì)菌(Uncultured bacterium)更接近(圖3)。
由圖3可知,各菌株的同源性都在81.0%以上,最高達(dá)91.3%。目前已知細(xì)菌和植原體16SrDNA基因只要相差3%以上則可定為不同的種。與該內(nèi)生菌同源性最高的是未能夠培養(yǎng)細(xì)菌Uncultered candidated bacterGS242.seq和Uncultured bacterium clone yf5-180,達(dá)到 90.5% ~91.3%,故可認(rèn)為該內(nèi)生菌雖然與未能培養(yǎng)的細(xì)菌(Uncultured bacterium)的親緣關(guān)系較為接近,但該內(nèi)生菌應(yīng)該屬于一個(gè)新的菌株。
未能培養(yǎng)的細(xì)菌(Uncultured bacterium)主要是指尚未能夠完全分離培養(yǎng)的細(xì)菌。因?yàn)槟壳斑€沒(méi)有成功分離培養(yǎng)柑橘黃龍病病原的報(bào)道。研究表明,未能培養(yǎng)的細(xì)菌在柑橘黃龍病的內(nèi)生菌所占比例大于5%[7],該內(nèi)生菌可能為柑橘黃龍病的病原菌。16S rDNA存在于所有原核生物的細(xì)胞中,它是研究細(xì)菌分類、進(jìn)化和親緣關(guān)系的重要指標(biāo),可用于進(jìn)化程度不同的生物系統(tǒng)發(fā)育研究,特別對(duì)于不能進(jìn)行人工培養(yǎng)的細(xì)菌,利用其進(jìn)行分類是一個(gè)有力的工具。目前已知細(xì)菌和植原體16S rDNA基因只要相差3%以上則可定為不同的種[8]。
該研究運(yùn)用分子生物學(xué)的方法對(duì)廣東肇慶地區(qū)柑橘黃龍病植株體的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、序列測(cè)定及同源關(guān)系分析,確定了該植株的分類地位。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)柑橘黃龍病植株病原進(jìn)行了大量研究,以期為柑橘黃龍病的防治提供參考依據(jù)。從該研究擴(kuò)增到的肇慶柑橘黃龍病植原體16S rDNA基因中發(fā)現(xiàn)一個(gè)特殊的序列,在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性對(duì)比中,與其相似度最高的是Uncultered candidated bacterGS242.seq 和 Uncultured bacterium clone yf5-180,達(dá)到90.5% ~91.3%。同源性相差3%,即可認(rèn)為是不同種。盡管有研究利用含有柑橘葉脈提取物的培養(yǎng)基能成功培養(yǎng)出亞洲種黃龍病病原菌,并完成其柯赫氏法則驗(yàn)證的報(bào)道[9],但該試驗(yàn)為孤例,尚無(wú)重復(fù)成功的報(bào)道[9]。除了個(gè)例,目前還沒(méi)有成功分離培養(yǎng)柑桔黃龍病病原的報(bào)道,所以該研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)尚未發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌種屬。此細(xì)菌很有可能是柑橘黃龍病的病原菌。對(duì)于此細(xì)菌的研究是一個(gè)較為有價(jià)值的課題。
[1]田亞南,柯穗,李韜.應(yīng)用電鏡與PCR技術(shù)檢測(cè)王官溪蜜柚黃龍病病原[J].植物病理學(xué)報(bào),2000,30(1):76 -81.
[2]LI W,LEVY L,HARTUNG J S.Quantitative distribution of Candidatus Liberibacter siaticus in citrus plants with citrus huanglongbing[J].Phytopathology,2009,99:139 -144.
[3]孔維文,鄧曉玲,梁志慧,等.柑桔黃龍病病原DNA片段的克隆及序列分析[J].植物病理學(xué)報(bào),2000,30(1):71 -75.
[4]張會(huì)敏,馮友軍.一株野生細(xì)菌的16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建[J].生物信息學(xué)報(bào),2004,8(3):2 -4.
[5]廖曉蘭,朱水芳,趙文軍,等.柑橘黃龍病病原16S rDNA克隆、測(cè)序及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2004,12(1):80-85.
[6]單振菊,馮震,周根,等.沙田柚黃龍病病原16S rDNA片段的克隆與序列分析[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2006,25(1):61 -65.
[7]王愛(ài)華,殷幼平,熊紅利,等.廣西柑橘黃龍病植株韌皮部?jī)?nèi)生細(xì)菌多樣性分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(23):4823 -4833.
[8]單振菊,馮震,周根,等.南方5省區(qū)柑橘黃龍病病原16S rDNA片段的克隆與序列分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,1(2):29.
[9]SECHLER A,SCHUENZEL E L,COOKE P,et al.Cultivation of‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,‘Ca.L.africanus’,and’Ca.L.americanus’associated with Huanglongbing[J].Phytopathology,2009,99(5):480 -486.