李 闖，王 超，胡雪芹*，張洪斌(.合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，安徽合肥30009;.合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽合肥30009)

葡聚糖的生產(chǎn)是制備多糖類產(chǎn)品的技術(shù)核心，隨著我國蔗糖農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其產(chǎn)值每年劇增，而右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrases)在其中扮演著重要角色。該酶能夠水解斷裂蔗糖分子內(nèi)的α(1→2)糖苷鍵并將D-吡喃葡萄糖基催化轉(zhuǎn)移到與酶分子C端的葡聚糖鉚合域(Glucan binding domains)緊密結(jié)合的右旋糖酐大分子鏈上［1］，從而生成百萬級分子量的右旋糖酐。在整個(gè)催化反應(yīng)過程中果糖被釋放出來，并大量游離于催化體系中。

果糖(Fructose)，分子式為C6H12O6，是一種最為常見的己酮糖，與葡萄糖是同分異構(gòu)體，被認(rèn)為是最甜最優(yōu)的天然營養(yǎng)型甜味劑。果糖的代謝過程不依賴胰島素［2］，其注射液可用于燒傷、創(chuàng)傷、術(shù)后及感染等胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下或不適宜使用葡萄糖時(shí)需補(bǔ)充水分或能源的患者的補(bǔ)液治療。此外，果糖還具有促進(jìn)微量元素吸收、保護(hù)肝細(xì)胞、輔助治療酒精中毒、預(yù)防齲齒和強(qiáng)化耐力等保健功能。其中，結(jié)晶果糖由于具有純度高、性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)而逐漸在食品、醫(yī)藥等行業(yè)得到開發(fā)與應(yīng)用，其市場需求將不斷擴(kuò)大［3］。

然而，由于果糖獨(dú)特的理化性質(zhì)又使其晶體的制備技術(shù)面臨著兩大瓶頸。一是果糖在純水中的溶解度極大(30℃下果糖的飽和溶液濃度為81.9%，m/m)，致使飽和溶液的黏度也很大，較大的黏度會(huì)降低母液的流動(dòng)性，阻礙結(jié)晶過程中的傳質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，向結(jié)晶體系內(nèi)加入乙醇等能夠與水互溶的有機(jī)試劑可以降低果糖的溶解度與其母液的黏度［4－5］。Flood等［6］分別對果糖在不同的水－乙醇比例和不同溫度下的折射指數(shù)、黏度、密度和溶解度等進(jìn)行了較為深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在水∶乙醇為1∶4(m/m)的體系下果糖的溶解度大幅度減少且結(jié)晶母液的黏度大幅下降，故將此作為果糖結(jié)晶體系，進(jìn)行較為細(xì)致的工藝參數(shù)研究。除加入乙醇，也有通過加入表面活性劑來改善糖漿的黏度［7］。二是果糖的理化性質(zhì)較為活潑，晶體放置在空氣中極易吸水潮解，在加熱過程中容易氧化分解生成棕黃色的5-羥甲基糠醛［8］，而后者作為雜質(zhì)在我國藥典中受到嚴(yán)格控制［9］。

筆者以前期工作摸索出的最佳酶催化及純化條件為基礎(chǔ)，研究了果糖在水－乙醇體系中的結(jié)晶條件，并進(jìn)行了相關(guān)工藝參數(shù)的優(yōu)化，最后，對結(jié)晶產(chǎn)品進(jìn)行了高效液相色譜、中紅外光譜及元素檢測分析，以期解決果糖結(jié)晶中所遇到的上述兩大問題，為實(shí)現(xiàn)葡聚糖生產(chǎn)過程中副產(chǎn)物果糖的回收利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 果糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，BR)，色譜級乙腈(TEDIA公司)，無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR)。

右旋糖酐蔗糖酶粗酶液(80 U/ml)來自重組大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET28-dexYG(合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院藥物設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏)，酶的制備方法參見文獻(xiàn)［10］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果糖的酶法制備。

1.2.1.1 右旋糖酐蔗糖酶的酶催化反應(yīng)。用乙酸－乙酸鈣緩沖液配制濃度為125 g/L的蔗糖底物溶液作為酶的催化反應(yīng)體系，并按2 U/ml的用量比例加入右旋糖酐蔗糖酶酶液，控制溫度在25～30℃，150 r/min反應(yīng)30 h。

1.2.1.2 果糖的分離與純化。酶的催化體系在70℃下水浴加熱20 min以終止反應(yīng)，加入乙醇沉淀、過濾去除右旋糖酐，之后濃縮上清液去除乙醇及部分水，濃縮得到的糖漿再經(jīng)鈣型陽離子交換樹脂色譜分離精制后得到純度較高的果糖溶液。

1.2.2 果糖結(jié)晶條件的研究。

1.2.2.1 晶種的制備。將結(jié)晶果糖在研缽中研磨過篩，取100～150目的粉末作為晶種，其粒徑在100～165 μm，密封保存以備用。

1.2.2.2 結(jié)晶方法。將果糖溶液濃縮至一定濃度后，按照水∶乙醇=1∶4的質(zhì)量比加入無水乙醇提高結(jié)晶母液的流動(dòng)性和過飽和度，之后加入果糖晶種，控制整個(gè)結(jié)晶體系以0.5～1.0℃/h的降溫速率從50℃至10℃冷卻結(jié)晶，期間保持150 r/min的攪拌轉(zhuǎn)速。最后經(jīng)過濾、乙醇清洗、60～70℃真空干燥至恒重，計(jì)算結(jié)晶收率。

結(jié)晶收率的計(jì)算公式:

1.2.2.3 結(jié)晶母液的純度對結(jié)晶的影響。按照酶催化反應(yīng)液中所含有的組分及含量，將蔗糖、葡萄糖和麥芽糖按照2∶1∶4的比例充分混合，分別配制成果糖純度為75%、80%、85%、90%、95%(m/m)的混合糖溶液，并按照基本試驗(yàn)方法進(jìn)行結(jié)晶。

1.2.2.4 母液白利度對結(jié)晶收率的影響。將精制后純度在90%以上的果糖溶液濃縮至70、75、80、85 和90 Brix°，進(jìn)行批次冷卻結(jié)晶，依次測定結(jié)晶收率，重復(fù)3次并取平均值作圖。

1.2.2.5 晶種的添加量對結(jié)晶收率的影響。將精制后純度在90%以上的果糖溶液濃縮至85 Brix°，分別添加總固形物質(zhì)量0、5%、10%、15%和20%的果糖晶種進(jìn)行批次冷卻結(jié)晶，依次測定結(jié)晶收率，重復(fù)3次并取平均值作圖。

1.2.2.6 養(yǎng)晶時(shí)間對結(jié)晶收率的影響。將精制后純度在90%以上果糖溶液濃縮至85 Brix°，并添加總固形物質(zhì)量10%的果糖晶種，經(jīng)冷卻結(jié)晶過程之后保持15℃和150 r/min的轉(zhuǎn)速分別養(yǎng)晶0、3、6、9和12 h后，依次測定結(jié)晶收率，重復(fù)3次并取平均值作圖。

1.2.3 分析檢測方法。

1.2.3.1 純度的檢測。果糖溶液純度的測定采用高效液相色譜層析(HPLC)外標(biāo)法［11］，德國 Waters示差檢測器，色譜條件為:Rezex RCM-Monosaccharide Ca+2(300 mm ×7.80 mm)，柱溫為85 ℃，流動(dòng)相為去離子水，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量為20 μl。以被檢物質(zhì)的濃度Y(mg/ml)對峰面積的lg值x作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別為:Y=0.214+2.774x;R=0.988 4，線性范圍在20 ～120 mg/ml。

1.2.3.2 結(jié)晶產(chǎn)物中5－羥甲基糠醛的檢測。取0.5 g結(jié)晶產(chǎn)物，加水10 ml充分溶解后，經(jīng)紫外－可見分光光度法檢測，在284 nm 波長處測定，吸光度不能超過 0.32［9］。

1.2.3.3 其他檢測方法。溶液中總固形物含量的測定采用阿貝折光儀，即折光法，單位為Brix°，又稱白利度。

傅立葉中紅外光譜分析采用溴化鉀壓片，檢測波數(shù)在4 000 ～400 cm－1。

元素分析測定條件為爐溫1 150℃，還原管850℃，對結(jié)晶果糖進(jìn)行元素含量測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)晶母液的純度對結(jié)晶的影響 結(jié)晶雖然是一種有效的分離手段，但雜質(zhì)，甚至是微量的雜質(zhì)會(huì)給結(jié)晶過程帶來很大影響［12］，如果結(jié)晶母液中目的產(chǎn)物的純度達(dá)不到結(jié)晶要求，最終可能只得到產(chǎn)物與雜質(zhì)的無定型油狀沉積物［13］。Chu等［14］分別以葡萄糖和聚果二糖作為果糖結(jié)晶過程中的雜質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，雜質(zhì)的存在在一定程度上影響晶體的生長速率。在相同純度條件下含有聚果二糖結(jié)晶體系的平均生長速率比含有葡萄糖的結(jié)晶體系低。因此，母液的純度對物質(zhì)的結(jié)晶起著至關(guān)重要的作用。

表1 母液的純度對結(jié)晶的影響

在其他雜糖的干擾下果糖晶體的生長速率明顯減小，宏觀體現(xiàn)在最終的結(jié)晶收率上。此外，雜糖含量過多還會(huì)對結(jié)晶體系的穩(wěn)定性造成破壞，在果糖純度只有75%時(shí)，結(jié)晶母液在加入乙醇改性之后體系會(huì)迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘咨?5］，為保證較高的結(jié)晶率以及較好的晶體質(zhì)量，要求純度在90%以上的果糖才可以進(jìn)行結(jié)晶(表1)。

2.2 母液白利度對結(jié)晶收率的影響 母液白利度對結(jié)晶收率的影響見圖1。由圖1可知，起始結(jié)晶時(shí)母液的白利度在75 Brix°以下時(shí)沒有結(jié)晶果糖生長或產(chǎn)率極低，說明此濃度下糖漿溶液在降溫過程中始終沒有達(dá)到結(jié)晶所要求的過飽和度。此外，結(jié)晶產(chǎn)率在母液的白利度達(dá)到80 Brix°以上時(shí)顯著提高，(在 85 Brix°時(shí)最大，為 52.36%)，在 90 Brix°時(shí)雖然有所增加但濃縮時(shí)間越長，果糖越容易氧化變色，且產(chǎn)率增加不大，綜合考慮認(rèn)為起始結(jié)晶時(shí)母液的白利度在85 Brix°左右最為合適。在此條件下，可以計(jì)算出50℃、水－乙醇比例為 1∶4的結(jié)晶體系下的初始過飽和度為 1.21［6，16］。

2.3 晶種的添加量對結(jié)晶收率的影響 晶種的添加量對結(jié)晶收率的影響見圖2。由圖2可知，當(dāng)晶種添加量在總固形物質(zhì)量10%時(shí)收率最高，達(dá)到56.73%。在不添加晶種時(shí)雖然也有結(jié)晶析出，但由于沒有外加晶種的誘導(dǎo)作用只靠自發(fā)成核生長;當(dāng)晶種添加過多時(shí)會(huì)由于晶體粒徑不均勻所產(chǎn)生的奧斯特瓦爾德熟化(Ostwald Ripening)、生長速率分散(Growth Rate Dispersions)等現(xiàn)象的發(fā)生，使得收率降低和結(jié)晶質(zhì)量下降［17－18］。

2.4 養(yǎng)晶時(shí)間對結(jié)晶收率的影響 養(yǎng)晶時(shí)間對結(jié)晶收率的影響見圖3。由圖3可知，養(yǎng)晶時(shí)間對于結(jié)晶收率的影響作用較小，在養(yǎng)晶時(shí)間達(dá)到9 h時(shí)收率達(dá)到最大60.51%，且一直維持在60%左右。

2.5 酶法制備結(jié)晶果糖的檢測與分析

2.5.1 高效液相色譜(HPLC)檢測。將精制后的催化反應(yīng)液與結(jié)晶產(chǎn)物溶液分別進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果見圖4。由圖4可知，果糖在鈣離子色譜柱的出峰時(shí)間為14 min左右，表明純化精制后的果糖經(jīng)結(jié)晶操作后其純度有很大提高。

2.5.2 傅立葉中紅外光譜檢測分析。由圖5可知，制備的結(jié)晶果糖與標(biāo)品均在3 400、2 890、2 830、1 640、1 410、1 080、868和818 cm－1處有較強(qiáng)的吸收峰，其中，3 400 cm－1附近為糖分子中 －OH的伸縮振動(dòng)峰，2 890與2 830 cm－1為 C-H伸縮振動(dòng)峰，1 640 cm－1為糖類－OH的吸收峰，1 410 cm－1為C-H的彎曲振動(dòng)峰，1 080 cm－1為糖環(huán)的特征吸收峰，868與818 cm－1為吡喃環(huán)的特有吸收峰［19－20］，證明了結(jié)晶形態(tài)下的果糖是一種吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)［21］。

2.5.3 元素分析。由表2可知，該結(jié)果符合果糖(C6H12O6)中各個(gè)元素所占比例的理論值，所以通過該方法得到的結(jié)晶果糖中不含游離水及結(jié)晶水。

表2 元素分析 %

3 結(jié)論與討論

該研究較為詳細(xì)地探索了果糖在水－乙醇為1∶4體系下的結(jié)晶條件，并對部分工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。首先，母液的純度是果糖結(jié)晶的必要前提，雜質(zhì)含量大于10%的體系在加入乙醇改性后，體系的穩(wěn)定性降低，最終僅得到油狀沉淀物。其次，與過飽和度密切相關(guān)的濃度參數(shù)同樣對結(jié)晶產(chǎn)生重大影響。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)晶收率在母液的白利度達(dá)到80 Brix°以上時(shí)顯著提高，此條件下的過飽和度在1.20左右。此外，晶種的量與養(yǎng)晶時(shí)間均對結(jié)晶收率具有一定的影響。

試驗(yàn)中果糖作為右旋糖酐蔗糖酶的副產(chǎn)物得到有效的回收，且相對于國內(nèi)一些利用該酶制備結(jié)晶果糖的工藝，其流程得到較大簡化，加之結(jié)晶過程能耗低，符合當(dāng)今綠色工業(yè)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的要求，為結(jié)晶果糖的制備開辟了一條嶄新的道路。

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