唐克晶 林冬 魏輝 劉云濤 周春林 王迎 秘營昌 王建祥 王敏

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300020

FLT3基因位于染色體13q12，全長約100 kb，包含24個(gè)外顯子，編碼含993個(gè)氨基酸殘基的蛋白，F(xiàn)LT3蛋白屬于Ⅲ型受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK），即血小板源性生長因子受體亞家族[1-2]。FLT3與其配體之間的相互作用在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的增殖、分化及存活中發(fā)揮十分重要的作用[3-5]。當(dāng)配體與FLT3的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)，F(xiàn)LT3發(fā)生二聚體化，可介導(dǎo)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖和分化。如果FLT3基因發(fā)生突變，突變的FLT3能夠在非配體依賴的條件下發(fā)生自身磷酸化和組成性激活，進(jìn)而引起下游信號(hào)的異常轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響造血系統(tǒng)的正常發(fā)育，產(chǎn)生抗凋亡和分化阻滯兩種致癌作用[6-7]。有研究表明，F(xiàn)LT3-ITD及FLT3點(diǎn)突變與急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）密切相關(guān)，并已證明FLT3-ITD是AML獨(dú)立的不良預(yù)后因素[8]，一些研究也提示，存在FLT3-TKD的AML患者預(yù)后不良[9]。目前，有關(guān)ALL患者中FLT3基因突變的研究較少[10]。我們檢測(cè)了147例ALL患者的FLT3突變情況，以探討FLT3突變?cè)贏LL中的發(fā)生率及臨床特點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

入組2006年7月至2011年10月我院收治的ALL初診患者共147例，其中男性有86例，女性61例，中位年齡為20歲（1.7～68歲）。診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)參照張之南等編著的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[11]，其中T細(xì)胞亞型（T-ALL）患者有29例（19.7%），B細(xì)胞亞型（B-ALL）患者有 97例（66.0%），費(fèi)城染色體陽性亞型（Ph+ALL）患者有21例（14.3%）。

1.2 基因組DNA的制備

采集患者新鮮骨髓5 ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞后，以血液、細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒（Tiangen公司產(chǎn)品）提取DNA，測(cè)定A260nm/A280nm值確定DNA產(chǎn)物的濃度及純度，并用去離子水將基因組DNA樣本稀釋至300 ng/μl。

1.3 產(chǎn)物的擴(kuò)增

1.3..11FLT3-ITD-ITD片段的擴(kuò)增 具體方法參照Ki yoi等[12]的文獻(xiàn)：根據(jù)第14、15外顯子序列設(shè)計(jì)引物，PCR法擴(kuò)增產(chǎn)物為329 bp，包含整個(gè)近膜區(qū)和激酶結(jié)構(gòu)域的起始部位，覆蓋了大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的ITD所在區(qū)域。引物由上海Invitrogen公司合成，上游引物序列為5′-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3′，下游引物序列為 5′-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3′。

擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×Taq PCR mastermix（Tiangen公司產(chǎn)品），上、下游引物各20 pmol/μl，900 ng 基因組DNA為模板，加去離子水至終體積50μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)35次，72℃延伸10 min。10μl擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外光透視儀分析圖像并照相，出現(xiàn)額外大于野生型FLT3的條帶即為ITD陽性產(chǎn)物。

1.3..22FLT3-TKD-TKD片段的擴(kuò)增 具體方法參照文獻(xiàn)[13]：根據(jù)第20外顯子和內(nèi)含子序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物為194 bp，包含了TKD的關(guān)鍵部位A-loop，此擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋了大多數(shù)D835和I836（Ile836）點(diǎn)突變所在區(qū)域。引物由上海Invitrogen公司合成，上游引物序列為 5′-CCAGGAACGTGCTTGTCA-3′，下游 引 物 序 列 為 5′-TCAAAAATGCACCACAGTGAG-3′。

反應(yīng)體系：2×Taq PCR mastermix（Tiangen公司產(chǎn)品），上、下游引物各20 pmol/μl，900 ng基因組DNA為模板，加去離子水至終體積50μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃ 1 min，56 ℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)35次，72℃延伸10 min。酚-氯仿抽提純化擴(kuò)增產(chǎn)物，以備酶切分析。

1.4 限制性酶切PCR產(chǎn)物分析

將所有檢測(cè)患者的FLT3-TKD擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行EcoRⅤ（Takara公司產(chǎn)品）酶切。大多數(shù)FLT3-TKD點(diǎn)突變均為D835或I836錯(cuò)義突變，而D835和I836組成了EcoRⅤ的酶切位點(diǎn)GATATC。如果此部位未發(fā)生突變，那么FLT3-TKD的擴(kuò)增產(chǎn)物（194 bp）將會(huì)被EcoRⅤ酶切成129 bp和65 bp兩個(gè)片段。相反，有突變的產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅤ酶切后會(huì)出現(xiàn)一個(gè)未被切開片段（194 bp）和兩段被切開片段（129 bp和65 bp）。

酶切反應(yīng)體系：10×buffer 2 μl，EcoR Ⅴ內(nèi)切酶（10 U/μl）1μl，擴(kuò)增純化產(chǎn)物10 μl，ddH2O 7 μl，總體系為20μl。反應(yīng)條件為37℃ 3 h。取10μl反應(yīng)液經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALL患者中FLT3突變的發(fā)生率

147例ALL患者中，共檢出FLT3突變11例，F(xiàn)LT3突變?cè)贏LL中的總發(fā)生率為7.5%，其中FLT3-ITD突變3例（2.0%），F(xiàn)LT3-TKD突變8例（5.5%）。FLT3-ITD野生型和突變型擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖1所示，F(xiàn)LT3-TKD野生型和突變型擴(kuò)增產(chǎn)物的EcoRⅤ酶切電泳結(jié)果如圖2所示。

2.2 FLT3突變陽性和陰性患者的一般資料比較

147例患者中，3例為ITD突變，8例為TKD突變，136例為FLT3野生型（表1）。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，F(xiàn)LT3突變者與無突變者在年齡、性別、骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)和外周血原始細(xì)胞計(jì)數(shù)方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。盡管FLT3-ITD突變陽性及突變陰性患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但FLT3-TKD突變陽性患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)有高于突變陰性患者的趨勢(shì)（P=0.067）。FLT3-TKD突變陽性及突變陰性患者血小板計(jì)數(shù)亦無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但FLT3ˉITD突變陽性患者的血小板計(jì)數(shù)也有高于突變陰性患者的趨勢(shì)（P=0.081）。

2.3 ALL不同亞型中FLT3突變的比較

FLT3-ITD在T-ALL患者中的發(fā)生率為6.9%，高于在其他亞型中的發(fā)生率；FLT3-TKD在T-ALL患者中的發(fā)生率為10.3%，高于其他亞型；但由于例數(shù)較少均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？傮w而言，F(xiàn)LT3突變?cè)赥-ALL患者中的發(fā)生率為17.2%，在其他亞型中的發(fā)生率為5.1%，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2，p＜0.001）。

表1 FLT3突變陽性與突變陰性患者的臨床資料

表2 FLT3突變?cè)贏 L L不同亞型中的發(fā)生情況

3 討論

FLT3基因突變與急性白血病的發(fā)生密切相關(guān)。近年，一系列針對(duì)FLT3突變的小分子抑制物已被研發(fā)出來，其中許多已處于臨床試驗(yàn)階段[3]。一些臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合FLT3抑制劑有望提高AML的療效[14-15]。以往關(guān)于FLT3突變的研究多集中于AML，而較少關(guān)注ALL患者中的FLT3突變。目前發(fā)現(xiàn)，伴有FLT3突變的ALL患者主要為嬰幼兒[16-17]。在對(duì)ALL-REZ-BFM（Acute Lymphoblastic Leukemia Relapse Berlin-Frankfurt-Münster，復(fù)發(fā)急性淋巴細(xì)胞白血病-柏林-法蘭克福-明斯特）研究組134例首次復(fù)發(fā)的ALL患者的研究中，Wellmann等[18]發(fā)現(xiàn)了3例FLT3突變的患者，其中2例為FLT3-TKD，1例為FLT3-ITD。Elyamany等[19]在77例ALL患者中檢測(cè)出2例（2.6%）FLT3突變，其中FLT3-ITD和FLT3-TKD各1例（1.3%）。另外，Grossmann等[20]對(duì)90例T-ALL患者進(jìn)行了FLT3-ITD（2.2%）和FLT3-TKD（1.1%）的檢測(cè)。

本研究檢測(cè)了我院147例ALL患者的FLT3基因突變情況，發(fā)現(xiàn)FLT3突變?cè)贏LL患者中的總發(fā)生率為7.5%，其中FLT3-ITD突變的發(fā)生率為2.0%，F(xiàn)LT3-TKD突變的發(fā)生率為5.5%。Chang等[21]發(fā)現(xiàn)，441例兒童ALL患者中有9例（2%）為FLT3突變陽性，AML患者中ITD突變的發(fā)生率較高，而ALL患者中的TKD突變更普遍，這與我們的研究結(jié)果相似。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3突變?cè)赥ALL患者中的發(fā)生率為17.2%，在其他亞型中的發(fā)生率為5.1%，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.001）。這提示，F(xiàn)LT3基因突變?cè)赥-ALL患者的發(fā)病過程中發(fā)揮更重要的作用。有研究[22]發(fā)現(xiàn)，攜帶FLT3基因突變的ALL患者與攜帶FLT3基因突變的AML患者的臨床特征有差異，這主要表現(xiàn)在發(fā)病初期的白細(xì)胞計(jì)數(shù)上，攜帶FLT3基因突變的AML患者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)往往較高；但本研究中攜帶FLT3-ITD突變的ALL患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)并不高，或與本研究入組的病例資料較少有關(guān)。

本研究檢測(cè)了ALL患者中FLT3基因突變的發(fā)生率，并發(fā)現(xiàn)了FLT3突變ALL患者有別于AML患者的一些臨床特點(diǎn)。雖然FLT3突變對(duì)ALL患者預(yù)后的意義還需更大系列的研究來探究，但本研究結(jié)果提示部分ALL患者存在FLT3突變，F(xiàn)LT3抑制劑或?qū)⒂糜谥委烝LL，并使患者獲益。

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