王藝茹，王雯婷，李亞楠，陳寶軍，張英杰，詹正烜，鄭乃熙，黃露露，賴興泉，蘇友新（福建中醫(yī)藥大學，福建福州350122）

·實驗研究·

腎陽虛大鼠股骨皮質骨差異蛋白質表達分析

王藝茹，王雯婷，李亞楠，陳寶軍，張英杰，詹正烜，鄭乃熙，黃露露，賴興泉，蘇友新（福建中醫(yī)藥大學，福建福州350122）

目的比較分析腎陽虛證模型大鼠與正常大鼠股骨皮質骨差異表達蛋白質，從骨組織功能蛋白質角度初步探討腎陽虛證的實質。方法60只雄性WISTAR大鼠隨機分為正常組和腎陽虛組，每組各30只，適應性喂養(yǎng)1周。腎陽虛組：臀部肌肉注射氫化可的松注射液2.5 mg／100 g，每日1次，自由飲水、飲食。正常組：自由飲食、飲水。注射造模干預15 d后繼續(xù)觀察3周。模型鑒定成功后分別獲取腎陽虛組和正常組大鼠股骨皮質骨標本，進行總蛋白的提取制備。采用雙向凝膠電泳（2-DE）技術展示2組大鼠的皮質骨蛋白質組圖譜，應用PDQuest軟件分析2組間差異表達蛋白點，采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）初步鑒定差異表達蛋白點。結果2組皮質骨2-DE凝膠圖譜可辨別蛋白點數目為470個；與正常組比較，腎陽虛組皮質骨中存在12個已知的差異表達蛋白，其中載脂蛋白A-I、α烯醇化酶和熱休克蛋白60表達上調，原肌球蛋白異構體2α-3鏈、I型膠原α-1鏈、GDP解離抑制因子β、LOC683667蛋白、白細胞酪氨酸激酶受體、線粒體ATP合酶亞基α、膜聯蛋白A3、丙酮酸激酶同工酶及蛋白質二硫鍵異構酶A3表達下調。結論股骨皮質骨12個蛋白表達改變可能與腎陽虛證的發(fā)生有關。

蛋白質組學；腎陽虛證；大鼠；骨組織；雙向電泳；質譜

“腎主骨”是中醫(yī)的經典理論之一，認為“腎”與“骨”存在著密切聯系，“腎強則骨強、腎虛則骨弱”，腎虛可以導致骨病，如骨軟化、骨質疏松、骨質增生、骨折愈合遲緩等。腎陰虛與腎陽虛是腎虛證的基本證型，腎陽虛證是由于素體陽虛、年高腎虧、房勞過度或久病傷腎等，使腎陽虧虛，機體失于溫煦所表現的一組證候，是中醫(yī)最常見的證候之一。對于腎陽虛證的證候實質，雖已取得一定的共識［1－2］，但至今它的發(fā)生機理還尚未完全清楚。隨著蛋白質組學技術在中醫(yī)學相關研究的廣泛應用，目前已經認識到中醫(yī)“證”的實質與疾病個體特定的功能蛋白質組及其基因組的表達水平密切相關，疾病不同中醫(yī)證型區(qū)別的實質是功能蛋白質組及其基因組的表達水平差異［3］。所以，基于中醫(yī)“腎主骨”理論，本研究擬從骨組織功能蛋白質表達水平差異的角度進一步探索腎陽虛證的實質。

1 材料和方法

1.1 實驗動物3月齡SPF級WISTAR大鼠60只，均為雄性，體重（210±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002，實驗動物質量合格證編號：2007000548 015。委托福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心代購及飼養(yǎng)。

1.2 主要藥物與試劑氫化可的松注射液（福州海王福藥制藥有限公司，產品批號：1209111）；大鼠環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）及環(huán)磷酸腺苷（cAMP）ELISA試劑盒購自上海Westang Bio-tech有限公司；固相PH梯度膠條（17 cm，pH 4-7 NL）、二硫蘇糖醇、3-［（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基］-1-丙磺酸（CHAPS）、ReadyStrip IEF緩沖液（Bio-lyte）、礦物油（Mineral Oil）、碘乙酰胺（IAA）、分離膠緩沖液（1.5 M Tris Hcl，PH 8.8）、丙烯酰胺預混液（30%AcyBis）、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（AP）、封膠液（ReadyPrep Overlay Agarose）、甘氨酸（Glycine）、考馬斯亮藍染色液、尿素、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、蛋白定量試劑盒及Ready Prep 2-D Clean up Kit均購自美國Bio-Rad公司；硫脲、乙腈（ACN）、甘油、碳酸氫銨（Ammonium bicarbonate）、三氟乙酸（TFA）均購自美國Sigma公司；TPCK-Trypsin胰蛋白酶購自美國Promega公司；Dnase、Rnase酶購自北京TransGen公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）購自碧云天生物技術研究所；蛋白酶抑制劑Cocktail購自上海Roche公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器64R高速低溫離心機（美國BECKMAN公司）；PROTEAN IEF Cell等電聚焦系統(tǒng)、PowerPacTM Universal電泳儀、PROTEANⅡxi垂直板電泳系統(tǒng)和灌膠模具（美國Bio-Rad公司）；Image Scanner掃描儀（美國GE公司）；ELX808酶聯免疫檢測儀（美國BIO-TEK）；Milli-Q超純水儀（德國Millipore公司）；Autoflex speed質譜儀（美國BRUKER公司）。

1.4 實驗動物分組及造模采用隨機數字表法將大鼠分為2組，即正常組、腎陽虛組各30只。適應性喂養(yǎng)1周后，腎陽虛組大鼠予臀部肌肉注射氫化可的松注射液（2.5 mg／100 g），每日1次，自由飲水、飲食，連續(xù)15 d［4］。正常組大鼠給予自由飲食、飲水。

1.5 模型鑒定及標本獲取注射造模后，繼續(xù)觀察3周，通過肉眼觀察大鼠活動、反應、弓背、毛色及飲食、飲水等情況，并測量大鼠體重與體溫（肛溫）及檢測大鼠血清cAMP、cGMP和cAMP／cGMP比值進行模型的鑒定［5］。確定模型成功后，用10%水合氯醛以300 mg／kg的劑量腹腔注射麻醉所有大鼠，在冰上操作迅速取下其股骨干，剔除軟組織及骨膜部分，并用骨剪剪開，用超純水將骨髓沖洗干凈，然后用刮匙將股骨干松質骨輕輕刮除后放入5 mL的Eppendorf管中，標記后置于液氮罐中，最后轉入－80℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 皮質骨總蛋白提取與制備取股骨皮質骨樣本1 g，放在盛有液氮的研缽里研磨粉碎后轉入EP管中，并加入1.5 mL樣品裂解液［7 mol／L尿素、2 mol／L硫脲、4%（W／V）CHAPS、1%（V／V）兩性電解質載體、50 mmol／L DTT、20 mmol／L Tris、20 mmol／L PMSF］，于4℃冰箱中裂解提取蛋白質4 h；然后置于低溫高速離心機以14 000 rpm離心30 min，吸取上清液；每1 mL裂解液加入2μL Dnase和2 μL Rnase，冰上放置15min；用超聲清洗儀超聲致液體不黏稠為止，然后4℃、14 000 rpm離心30 min，吸取上清液；2-D clean-up試劑盒按操作說明書提純濃縮蛋白；Bradford法［6］測定蛋白濃度并計算上樣蛋白體積。

1.7 雙向凝膠電泳根據美國Bio-Rad公司的2-DE操作指南和相關文獻［7］進行操作。第一向為IEF電泳，本實驗選用長17 cm，pH為4～7的IPG預制膠條，膠條泡脹電壓為50 V 12 h，電泳參數設定：250 V 1 h、1 000 V 1 h、4 000 V 3 h、8 000 V 11 h、500 V維持。聚焦完成后進行兩次膠條的平衡及潤洗，然后進行第二相SDS-PAGE電泳，起初恒壓100 V 40 min后，換用恒壓300 V 4.5 h，待示蹤溴酚藍跑至距凝膠底部約1 cm時停止電泳。

1.8 凝膠蛋白點染色及差異表達蛋白點靶定電泳結束后，輕輕撬開兩層玻璃板，取出凝膠，用考馬斯亮藍染色液染色過夜，然后用配好的脫色液進行多次脫色，直至膠的背景清晰且蛋白點明顯，再用Image Scanner掃描儀獲取2-DE凝膠圖片；應用PDQuest 8.0分析軟件進行凝膠圖譜蛋白點檢測，并以蛋白點相對標準化體積變化達1.5倍以上為標準進行差異表達蛋白的靶定。

1.9 質譜分析樣品制備將檢定的差異表達蛋白點從凝膠上手工切下，切成1 mm3大小置于1.5 mL EP管中；行脫色、脫水等處理后進行胰蛋白酶酶解；酶解后取上清液移至另一新的0.5 mL EP管中，剩下的膠塊加入100μL萃取液（60%ACN，含0.1% TFA），超聲15 min，離心，合并上清液，凍干，待做質譜分析。

1.10 質譜分析與數據庫搜索完全凍干的樣品用0.1%TFA重溶，進行質譜分析。采用板上混合點樣的方法進行質譜鑒定，然后應用flex analysis軟件對獲得的質譜數據進行分析，分析后的每一個樣品的一級和二級質譜數據再整合成一個文件，使用MASCOT（V3.2，Matrix Science，London，U.K）搜庫軟件進行檢索，MASCOT蛋白質顯著性檢驗，P＜0.05被認為是可靠的鑒定結果。

1.11 統(tǒng)計學處理使用SPSS17.0軟件對2組大鼠測量的數據進行統(tǒng)計學分析，計量數據屬正態(tài)分布均以x±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.01為有非常顯著性差異。

2 結果

2.1 2組大鼠一般狀態(tài)及環(huán)核苷酸系統(tǒng)比較造模后，腎陽虛組大鼠出現活動減少、反應遲鈍、體毛枯疏并失去光澤、爪甲與耳朵顏色變淡、弓背蜷縮、喜扎堆等畏寒怕冷表現，采食量與飲水量減少，體溫及體重顯著下降（P＜0.01），見表1、表2。cAMP含量下降，cGMP含量升高，cAMP／cGMP比值降低，均有非常顯著性差異（P＜0.01），見表3。

表1 2組大鼠體重比較（±s）g

表1 2組大鼠體重比較（±s）g

注：與正常組比較，1）P＜0.01。

造模后第2 1天3 7 1 . 9 0 ± 1 8 . 5 6 2 9 0 . 6 3 ± 1 4 . 5 91）組別正常組腎陽虛組n 3 0 2 7造模前2 5 4 . 1 0 ± 1 4 . 6 9 2 5 3 . 9 3 ± 1 5 . 5 0造模第1 5天3 0 5 . 6 7 ± 1 8 . 3 5 2 6 7 . 4 8 ± 1 5 . 5 31）

表2 2組大鼠體溫比較（±s）℃

表2 2組大鼠體溫比較（±s）℃

注：與正常組比較，1）P＜0.01。

造模后第21天38.13±0.34 37.33±0.311）組別正常組腎陽虛組n 30 27造模前38.12±0.30 38.11±0.39造模第15天38.13±0.33 37.17±0.371）

表3 造模后第21天2組大鼠cAMP、cGMP含量比較（±s）

表3 造模后第21天2組大鼠cAMP、cGMP含量比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01。

cAMP／cGMP 4.65±1.03 0.89±0.261）組別正常組腎陽虛組n 5 5 cAMP／（pmol·mL-1）36.20±2.98 23.44±7.231）cGMP／（pmol·mL-1）8.00±1.33 26.18±1.621）

2.2 皮質骨總蛋白雙向電泳圖譜及差異表達蛋白點標識結果見圖1，經過蛋白點檢測，2組凝膠圖譜可辨識的蛋白點數目均為470個。通過軟件對蛋白點的匹配分析并結合人工對比綜合判斷，檢測到12個明顯差異表達蛋白點。以正常組為參考，其中點1207、4302、3105、3705、7006、8105、8305、7401、6800為下調表達，6104、4108、6706為上調表達。

2.3 差異表達蛋白的MAIDI-TOF-MS質譜鑒定將明顯差異表達的12個蛋白質點從凝膠上手工切下，經胰蛋白酶酶解消化后進行MALDI-TOF-MS質譜分析。獲得的肽質量指紋圖譜信號強且基線較平穩(wěn)，噪音低，適于進行數據庫檢索。根據12個差異表達蛋白點肽段的MS和MS／MS質譜圖信息，使用MASCOT搜庫軟件進行蛋白質點鑒定，表4為質譜鑒定的蛋白點相關信息，包括蛋白質的編號、蛋白質種類、分子量、等電點等。

圖1 股骨皮質骨總蛋白雙向電泳圖譜及差異蛋白點標識

表4 差異表達蛋白的MALDI-TOF-TOF／MS鑒定結果

2.4 差異表達蛋白相關功能的生物信息學檢索將質譜鑒定確立的12種已知差異表達蛋白名稱輸入UniProt及NCBI蛋白質數據庫中進行蛋白相關功能的生物信息學檢索，結果見表5。

2.5 腎陽虛大鼠皮質骨差異表達蛋白的種類根據差異表達蛋白點標識與質譜鑒定結果得出：腎陽虛大鼠股骨干皮質骨中存在上調表達的蛋白3個，分別為載脂蛋白A-I、α烯醇化酶和熱休克蛋白60；下調表達的蛋白9個，分別為原肌球蛋白異構體2α-3鏈、I型膠原α-1鏈、GDP解離抑制因子β、LOC683667蛋白、白細胞酪氨酸激酶受體、線粒體ATP合酶亞基α、膜聯蛋白A3、丙酮酸激酶同工酶及蛋白質二硫鍵異構酶A3。

3 討論

蛋白質組的相關研究是后基因組研究的重要內容［8］，它從整體上對細胞、組織或者有機體整體蛋白質組進行研究與分析，從而在更深層面闡明生命的現象與本質。蛋白質組學技術具有高通量、橫向平行及動態(tài)性等優(yōu)勢，可以研究健康或病理狀態(tài)下相同個體生命活動規(guī)律所表現的總體蛋白質的差異，借以闡明疾病機理、解釋藥物作用機制、鑒定疾病分子標志物、揭示中醫(yī)證候實質等，且方法也不斷成熟與穩(wěn)定，是當前生物醫(yī)學領域的重要研究平臺［9－10］。腎陽虛證的證候表現一定有其物質基礎［11］，這個物質基礎可能就是一組差異表達的蛋白質，因為蛋白質是生命征象（包括各種癥狀、體征的疾病癥候）的體現者，是執(zhí)行生命功能的載體［12－13］?！澳I主骨”是中醫(yī)“臟象”學說的重要內容之一，認為骨的盛衰健壯與腎的功能密切相關，腎虛可以導致骨病，也就是說骨組織的代謝變化與生化改變與“腎”功能狀態(tài)存在著對應關系，那么骨組織的功能蛋白質組表達水平與腎陽虛證之間也必然存在著關聯性?；谝陨系恼J識，本研究借助于蛋白質組學的技術與方法，基于中醫(yī)“腎主骨”的理論，從大鼠股骨皮質骨差異表達蛋白質表達角度探討腎陽虛證的部分實質。

表5 蛋白質相關功能的生物信息學檢索結果

本實驗通過肌注氫化可的松建立腎陽虛證候模型大鼠，并采用大鼠相關狀態(tài)的觀察及血清環(huán)核苷酸系統(tǒng)的檢測對模型進行鑒定。研究結果表明：腎陽虛證模型大鼠的癥狀、體征和血清cAMP、cGMP含量檢測及cAMP／cGMP比值結果均符合腎陽虛證模型的鑒定要求［14］，提示腎陽虛模型造模是成功的。

通過對大鼠股骨皮質骨蛋白質組圖譜、差異表達蛋白點比較分析以及質譜鑒定的結果分析表明：相對于正常組，腎陽虛組股骨皮質骨載脂蛋白AI、α烯醇化酶和熱休克蛋白60等3個蛋白表達上調，原肌球蛋白異構體2α-3鏈、I型膠原α-1鏈、GDP解離抑制因子β、LOC683667蛋白、白細胞酪氨酸激酶受體、線粒體ATP合酶亞基α、膜聯蛋白A3、丙酮酸激酶同工酶及蛋白質二硫鍵異構酶A3等9個蛋白表達下調。這些差異的蛋白質按功能可以大致分為4類：①催化類蛋白4個：如丙酮酸激酶同工酶、ATP合酶亞基α、蛋白質二硫鍵異構酶A3、α烯醇化酶；②結構及支架類蛋白質2個：I型膠原α-1鏈、原肌球蛋白異構體2α-3鏈；③轉運類蛋白質2個：LOC683667、載脂蛋白A-I；④調節(jié)類蛋白質4個：膜聯蛋白A3、GDP解離抑制因子β、白細胞酪氨酸激酶受體、線粒體熱休克蛋白60。以上研究結果提示：上述12種蛋白的表達差異與腎陽虛證的發(fā)生存在著密切聯系，這些蛋白質表達異?？赡芡ㄟ^股骨干皮質骨結構構成、化學反應、物質轉運、新陳代謝和細胞凋亡等方面的改變而影響腎陽虛證的發(fā)生及出現各種癥候群。

本研究僅初步比較并確認正常大鼠與腎陽虛證候模型大鼠中股骨皮質骨的差異表達蛋白質，對它們的鑒定與驗證有待于今后進一步的研究。

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R274

A

1000-338X（2015）06-0050-04

2015-10-05

國家自然科學基金資助項目（81273888）

王藝茹（1986—），女，碩士研究生。

蘇友新（1969—），男，醫(yī)學博士，教授，博士生導師。E-mail：suyouxin777@hotmail.com