王藝茹,王雯婷,李亞楠,陳寶軍,張英杰,詹正烜,鄭乃熙,黃露露,賴興泉,蘇友新(福建中醫(yī)藥大學(xué),福建福州350122)
·實(shí)驗(yàn)研究·
腎陽(yáng)虛大鼠股骨皮質(zhì)骨差異蛋白質(zhì)表達(dá)分析
王藝茹,王雯婷,李亞楠,陳寶軍,張英杰,詹正烜,鄭乃熙,黃露露,賴興泉,蘇友新(福建中醫(yī)藥大學(xué),福建福州350122)
目的比較分析腎陽(yáng)虛證模型大鼠與正常大鼠股骨皮質(zhì)骨差異表達(dá)蛋白質(zhì),從骨組織功能蛋白質(zhì)角度初步探討腎陽(yáng)虛證的實(shí)質(zhì)。方法60只雄性WISTAR大鼠隨機(jī)分為正常組和腎陽(yáng)虛組,每組各30只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。腎陽(yáng)虛組:臀部肌肉注射氫化可的松注射液2.5 mg/100 g,每日1次,自由飲水、飲食。正常組:自由飲食、飲水。注射造模干預(yù)15 d后繼續(xù)觀察3周。模型鑒定成功后分別獲取腎陽(yáng)虛組和正常組大鼠股骨皮質(zhì)骨標(biāo)本,進(jìn)行總蛋白的提取制備。采用雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)展示2組大鼠的皮質(zhì)骨蛋白質(zhì)組圖譜,應(yīng)用PDQuest軟件分析2組間差異表達(dá)蛋白點(diǎn),采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)初步鑒定差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。結(jié)果2組皮質(zhì)骨2-DE凝膠圖譜可辨別蛋白點(diǎn)數(shù)目為470個(gè);與正常組比較,腎陽(yáng)虛組皮質(zhì)骨中存在12個(gè)已知的差異表達(dá)蛋白,其中載脂蛋白A-I、α烯醇化酶和熱休克蛋白60表達(dá)上調(diào),原肌球蛋白異構(gòu)體2α-3鏈、I型膠原α-1鏈、GDP解離抑制因子β、LOC683667蛋白、白細(xì)胞酪氨酸激酶受體、線粒體ATP合酶亞基α、膜聯(lián)蛋白A3、丙酮酸激酶同工酶及蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3表達(dá)下調(diào)。結(jié)論股骨皮質(zhì)骨12個(gè)蛋白表達(dá)改變可能與腎陽(yáng)虛證的發(fā)生有關(guān)。
蛋白質(zhì)組學(xué);腎陽(yáng)虛證;大鼠;骨組織;雙向電泳;質(zhì)譜
“腎主骨”是中醫(yī)的經(jīng)典理論之一,認(rèn)為“腎”與“骨”存在著密切聯(lián)系,“腎強(qiáng)則骨強(qiáng)、腎虛則骨弱”,腎虛可以導(dǎo)致骨病,如骨軟化、骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)增生、骨折愈合遲緩等。腎陰虛與腎陽(yáng)虛是腎虛證的基本證型,腎陽(yáng)虛證是由于素體陽(yáng)虛、年高腎虧、房勞過(guò)度或久病傷腎等,使腎陽(yáng)虧虛,機(jī)體失于溫煦所表現(xiàn)的一組證候,是中醫(yī)最常見(jiàn)的證候之一。對(duì)于腎陽(yáng)虛證的證候?qū)嵸|(zhì),雖已取得一定的共識(shí)[1-2],但至今它的發(fā)生機(jī)理還尚未完全清楚。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)學(xué)相關(guān)研究的廣泛應(yīng)用,目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到中醫(yī)“證”的實(shí)質(zhì)與疾病個(gè)體特定的功能蛋白質(zhì)組及其基因組的表達(dá)水平密切相關(guān),疾病不同中醫(yī)證型區(qū)別的實(shí)質(zhì)是功能蛋白質(zhì)組及其基因組的表達(dá)水平差異[3]。所以,基于中醫(yī)“腎主骨”理論,本研究擬從骨組織功能蛋白質(zhì)表達(dá)水平差異的角度進(jìn)一步探索腎陽(yáng)虛證的實(shí)質(zhì)。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3月齡SPF級(jí)WISTAR大鼠60只,均為雄性,體重(210±20)g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào):2007000548 015。委托福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)及飼養(yǎng)。
1.2 主要藥物與試劑氫化可的松注射液(福州海王福藥制藥有限公司,產(chǎn)品批號(hào):1209111);大鼠環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)及環(huán)磷酸腺苷(cAMP)ELISA試劑盒購(gòu)自上海Westang Bio-tech有限公司;固相PH梯度膠條(17 cm,pH 4-7 NL)、二硫蘇糖醇、3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、ReadyStrip IEF緩沖液(Bio-lyte)、礦物油(Mineral Oil)、碘乙酰胺(IAA)、分離膠緩沖液(1.5 M Tris Hcl,PH 8.8)、丙烯酰胺預(yù)混液(30%AcyBis)、四甲基乙二胺(TEMED)、過(guò)硫酸銨(AP)、封膠液(ReadyPrep Overlay Agarose)、甘氨酸(Glycine)、考馬斯亮藍(lán)染色液、尿素、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、蛋白定量試劑盒及Ready Prep 2-D Clean up Kit均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;硫脲、乙腈(ACN)、甘油、碳酸氫銨(Ammonium bicarbonate)、三氟乙酸(TFA)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;TPCK-Trypsin胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司;Dnase、Rnase酶購(gòu)自北京TransGen公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;蛋白酶抑制劑Cocktail購(gòu)自上海Roche公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.3 主要儀器64R高速低溫離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN公司);PROTEAN IEF Cell等電聚焦系統(tǒng)、PowerPacTM Universal電泳儀、PROTEANⅡxi垂直板電泳系統(tǒng)和灌膠模具(美國(guó)Bio-Rad公司);Image Scanner掃描儀(美國(guó)GE公司);ELX808酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)BIO-TEK);Milli-Q超純水儀(德國(guó)Millipore公司);Autoflex speed質(zhì)譜儀(美國(guó)BRUKER公司)。
1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為2組,即正常組、腎陽(yáng)虛組各30只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,腎陽(yáng)虛組大鼠予臀部肌肉注射氫化可的松注射液(2.5 mg/100 g),每日1次,自由飲水、飲食,連續(xù)15 d[4]。正常組大鼠給予自由飲食、飲水。
1.5 模型鑒定及標(biāo)本獲取注射造模后,繼續(xù)觀察3周,通過(guò)肉眼觀察大鼠活動(dòng)、反應(yīng)、弓背、毛色及飲食、飲水等情況,并測(cè)量大鼠體重與體溫(肛溫)及檢測(cè)大鼠血清cAMP、cGMP和cAMP/cGMP比值進(jìn)行模型的鑒定[5]。確定模型成功后,用10%水合氯醛以300 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉所有大鼠,在冰上操作迅速取下其股骨干,剔除軟組織及骨膜部分,并用骨剪剪開(kāi),用超純水將骨髓沖洗干凈,然后用刮匙將股骨干松質(zhì)骨輕輕刮除后放入5 mL的Eppendorf管中,標(biāo)記后置于液氮罐中,最后轉(zhuǎn)入-80℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.6 皮質(zhì)骨總蛋白提取與制備取股骨皮質(zhì)骨樣本1 g,放在盛有液氮的研缽里研磨粉碎后轉(zhuǎn)入EP管中,并加入1.5 mL樣品裂解液[7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(W/V)CHAPS、1%(V/V)兩性電解質(zhì)載體、50 mmol/L DTT、20 mmol/L Tris、20 mmol/L PMSF],于4℃冰箱中裂解提取蛋白質(zhì)4 h;然后置于低溫高速離心機(jī)以14 000 rpm離心30 min,吸取上清液;每1 mL裂解液加入2μL Dnase和2 μL Rnase,冰上放置15min;用超聲清洗儀超聲致液體不黏稠為止,然后4℃、14 000 rpm離心30 min,吸取上清液;2-D clean-up試劑盒按操作說(shuō)明書提純濃縮蛋白;Bradford法[6]測(cè)定蛋白濃度并計(jì)算上樣蛋白體積。
1.7 雙向凝膠電泳根據(jù)美國(guó)Bio-Rad公司的2-DE操作指南和相關(guān)文獻(xiàn)[7]進(jìn)行操作。第一向?yàn)镮EF電泳,本實(shí)驗(yàn)選用長(zhǎng)17 cm,pH為4~7的IPG預(yù)制膠條,膠條泡脹電壓為50 V 12 h,電泳參數(shù)設(shè)定:250 V 1 h、1 000 V 1 h、4 000 V 3 h、8 000 V 11 h、500 V維持。聚焦完成后進(jìn)行兩次膠條的平衡及潤(rùn)洗,然后進(jìn)行第二相SDS-PAGE電泳,起初恒壓100 V 40 min后,換用恒壓300 V 4.5 h,待示蹤溴酚藍(lán)跑至距凝膠底部約1 cm時(shí)停止電泳。
1.8 凝膠蛋白點(diǎn)染色及差異表達(dá)蛋白點(diǎn)靶定電泳結(jié)束后,輕輕撬開(kāi)兩層玻璃板,取出凝膠,用考馬斯亮藍(lán)染色液染色過(guò)夜,然后用配好的脫色液進(jìn)行多次脫色,直至膠的背景清晰且蛋白點(diǎn)明顯,再用Image Scanner掃描儀獲取2-DE凝膠圖片;應(yīng)用PDQuest 8.0分析軟件進(jìn)行凝膠圖譜蛋白點(diǎn)檢測(cè),并以蛋白點(diǎn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化體積變化達(dá)1.5倍以上為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的靶定。
1.9 質(zhì)譜分析樣品制備將檢定的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)從凝膠上手工切下,切成1 mm3大小置于1.5 mL EP管中;行脫色、脫水等處理后進(jìn)行胰蛋白酶酶解;酶解后取上清液移至另一新的0.5 mL EP管中,剩下的膠塊加入100μL萃取液(60%ACN,含0.1% TFA),超聲15 min,離心,合并上清液,凍干,待做質(zhì)譜分析。
1.10 質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)庫(kù)搜索完全凍干的樣品用0.1%TFA重溶,進(jìn)行質(zhì)譜分析。采用板上混合點(diǎn)樣的方法進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,然后應(yīng)用flex analysis軟件對(duì)獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,分析后的每一個(gè)樣品的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)再整合成一個(gè)文件,使用MASCOT(V3.2,Matrix Science,London,U.K)搜庫(kù)軟件進(jìn)行檢索,MASCOT蛋白質(zhì)顯著性檢驗(yàn),P<0.05被認(rèn)為是可靠的鑒定結(jié)果。
1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS17.0軟件對(duì)2組大鼠測(cè)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)屬正態(tài)分布均以x±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.01為有非常顯著性差異。
2.1 2組大鼠一般狀態(tài)及環(huán)核苷酸系統(tǒng)比較造模后,腎陽(yáng)虛組大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、體毛枯疏并失去光澤、爪甲與耳朵顏色變淡、弓背蜷縮、喜扎堆等畏寒怕冷表現(xiàn),采食量與飲水量減少,體溫及體重顯著下降(P<0.01),見(jiàn)表1、表2。cAMP含量下降,cGMP含量升高,cAMP/cGMP比值降低,均有非常顯著性差異(P<0.01),見(jiàn)表3。
表1 2組大鼠體重比較(±s)g
表1 2組大鼠體重比較(±s)g
注:與正常組比較,1)P<0.01。
造模后第2 1天3 7 1 . 9 0 ± 1 8 . 5 6 2 9 0 . 6 3 ± 1 4 . 5 91)組別正常組腎陽(yáng)虛組n 3 0 2 7造模前2 5 4 . 1 0 ± 1 4 . 6 9 2 5 3 . 9 3 ± 1 5 . 5 0造模第1 5天3 0 5 . 6 7 ± 1 8 . 3 5 2 6 7 . 4 8 ± 1 5 . 5 31)
表2 2組大鼠體溫比較(±s)℃
表2 2組大鼠體溫比較(±s)℃
注:與正常組比較,1)P<0.01。
造模后第21天38.13±0.34 37.33±0.311)組別正常組腎陽(yáng)虛組n 30 27造模前38.12±0.30 38.11±0.39造模第15天38.13±0.33 37.17±0.371)
表3 造模后第21天2組大鼠cAMP、cGMP含量比較(±s)
表3 造模后第21天2組大鼠cAMP、cGMP含量比較(±s)
注:與正常組比較,1)P<0.01。
cAMP/cGMP 4.65±1.03 0.89±0.261)組別正常組腎陽(yáng)虛組n 5 5 cAMP/(pmol·mL-1)36.20±2.98 23.44±7.231)cGMP/(pmol·mL-1)8.00±1.33 26.18±1.621)
2.2 皮質(zhì)骨總蛋白雙向電泳圖譜及差異表達(dá)蛋白點(diǎn)標(biāo)識(shí)結(jié)果見(jiàn)圖1,經(jīng)過(guò)蛋白點(diǎn)檢測(cè),2組凝膠圖譜可辨識(shí)的蛋白點(diǎn)數(shù)目均為470個(gè)。通過(guò)軟件對(duì)蛋白點(diǎn)的匹配分析并結(jié)合人工對(duì)比綜合判斷,檢測(cè)到12個(gè)明顯差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。以正常組為參考,其中點(diǎn)1207、4302、3105、3705、7006、8105、8305、7401、6800為下調(diào)表達(dá),6104、4108、6706為上調(diào)表達(dá)。
2.3 差異表達(dá)蛋白的MAIDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定將明顯差異表達(dá)的12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠上手工切下,經(jīng)胰蛋白酶酶解消化后進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析。獲得的肽質(zhì)量指紋圖譜信號(hào)強(qiáng)且基線較平穩(wěn),噪音低,適于進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。根據(jù)12個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)肽段的MS和MS/MS質(zhì)譜圖信息,使用MASCOT搜庫(kù)軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定,表4為質(zhì)譜鑒定的蛋白點(diǎn)相關(guān)信息,包括蛋白質(zhì)的編號(hào)、蛋白質(zhì)種類、分子量、等電點(diǎn)等。
圖1 股骨皮質(zhì)骨總蛋白雙向電泳圖譜及差異蛋白點(diǎn)標(biāo)識(shí)
表4 差異表達(dá)蛋白的MALDI-TOF-TOF/MS鑒定結(jié)果
2.4 差異表達(dá)蛋白相關(guān)功能的生物信息學(xué)檢索將質(zhì)譜鑒定確立的12種已知差異表達(dá)蛋白名稱輸入U(xiǎn)niProt及NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白相關(guān)功能的生物信息學(xué)檢索,結(jié)果見(jiàn)表5。
2.5 腎陽(yáng)虛大鼠皮質(zhì)骨差異表達(dá)蛋白的種類根據(jù)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)標(biāo)識(shí)與質(zhì)譜鑒定結(jié)果得出:腎陽(yáng)虛大鼠股骨干皮質(zhì)骨中存在上調(diào)表達(dá)的蛋白3個(gè),分別為載脂蛋白A-I、α烯醇化酶和熱休克蛋白60;下調(diào)表達(dá)的蛋白9個(gè),分別為原肌球蛋白異構(gòu)體2α-3鏈、I型膠原α-1鏈、GDP解離抑制因子β、LOC683667蛋白、白細(xì)胞酪氨酸激酶受體、線粒體ATP合酶亞基α、膜聯(lián)蛋白A3、丙酮酸激酶同工酶及蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3。
蛋白質(zhì)組的相關(guān)研究是后基因組研究的重要內(nèi)容[8],它從整體上對(duì)細(xì)胞、組織或者有機(jī)體整體蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究與分析,從而在更深層面闡明生命的現(xiàn)象與本質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有高通量、橫向平行及動(dòng)態(tài)性等優(yōu)勢(shì),可以研究健康或病理狀態(tài)下相同個(gè)體生命活動(dòng)規(guī)律所表現(xiàn)的總體蛋白質(zhì)的差異,借以闡明疾病機(jī)理、解釋藥物作用機(jī)制、鑒定疾病分子標(biāo)志物、揭示中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)等,且方法也不斷成熟與穩(wěn)定,是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究平臺(tái)[9-10]。腎陽(yáng)虛證的證候表現(xiàn)一定有其物質(zhì)基礎(chǔ)[11],這個(gè)物質(zhì)基礎(chǔ)可能就是一組差異表達(dá)的蛋白質(zhì),因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是生命征象(包括各種癥狀、體征的疾病癥候)的體現(xiàn)者,是執(zhí)行生命功能的載體[12-13]?!澳I主骨”是中醫(yī)“臟象”學(xué)說(shuō)的重要內(nèi)容之一,認(rèn)為骨的盛衰健壯與腎的功能密切相關(guān),腎虛可以導(dǎo)致骨病,也就是說(shuō)骨組織的代謝變化與生化改變與“腎”功能狀態(tài)存在著對(duì)應(yīng)關(guān)系,那么骨組織的功能蛋白質(zhì)組表達(dá)水平與腎陽(yáng)虛證之間也必然存在著關(guān)聯(lián)性?;谝陨系恼J(rèn)識(shí),本研究借助于蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)與方法,基于中醫(yī)“腎主骨”的理論,從大鼠股骨皮質(zhì)骨差異表達(dá)蛋白質(zhì)表達(dá)角度探討腎陽(yáng)虛證的部分實(shí)質(zhì)。
表5 蛋白質(zhì)相關(guān)功能的生物信息學(xué)檢索結(jié)果
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)肌注氫化可的松建立腎陽(yáng)虛證候模型大鼠,并采用大鼠相關(guān)狀態(tài)的觀察及血清環(huán)核苷酸系統(tǒng)的檢測(cè)對(duì)模型進(jìn)行鑒定。研究結(jié)果表明:腎陽(yáng)虛證模型大鼠的癥狀、體征和血清cAMP、cGMP含量檢測(cè)及cAMP/cGMP比值結(jié)果均符合腎陽(yáng)虛證模型的鑒定要求[14],提示腎陽(yáng)虛模型造模是成功的。
通過(guò)對(duì)大鼠股骨皮質(zhì)骨蛋白質(zhì)組圖譜、差異表達(dá)蛋白點(diǎn)比較分析以及質(zhì)譜鑒定的結(jié)果分析表明:相對(duì)于正常組,腎陽(yáng)虛組股骨皮質(zhì)骨載脂蛋白AI、α烯醇化酶和熱休克蛋白60等3個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),原肌球蛋白異構(gòu)體2α-3鏈、I型膠原α-1鏈、GDP解離抑制因子β、LOC683667蛋白、白細(xì)胞酪氨酸激酶受體、線粒體ATP合酶亞基α、膜聯(lián)蛋白A3、丙酮酸激酶同工酶及蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3等9個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。這些差異的蛋白質(zhì)按功能可以大致分為4類:①催化類蛋白4個(gè):如丙酮酸激酶同工酶、ATP合酶亞基α、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3、α烯醇化酶;②結(jié)構(gòu)及支架類蛋白質(zhì)2個(gè):I型膠原α-1鏈、原肌球蛋白異構(gòu)體2α-3鏈;③轉(zhuǎn)運(yùn)類蛋白質(zhì)2個(gè):LOC683667、載脂蛋白A-I;④調(diào)節(jié)類蛋白質(zhì)4個(gè):膜聯(lián)蛋白A3、GDP解離抑制因子β、白細(xì)胞酪氨酸激酶受體、線粒體熱休克蛋白60。以上研究結(jié)果提示:上述12種蛋白的表達(dá)差異與腎陽(yáng)虛證的發(fā)生存在著密切聯(lián)系,這些蛋白質(zhì)表達(dá)異??赡芡ㄟ^(guò)股骨干皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)構(gòu)成、化學(xué)反應(yīng)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、新陳代謝和細(xì)胞凋亡等方面的改變而影響腎陽(yáng)虛證的發(fā)生及出現(xiàn)各種癥候群。
本研究?jī)H初步比較并確認(rèn)正常大鼠與腎陽(yáng)虛證候模型大鼠中股骨皮質(zhì)骨的差異表達(dá)蛋白質(zhì),對(duì)它們的鑒定與驗(yàn)證有待于今后進(jìn)一步的研究。
[1]鄭海生,蔣健,賈偉.中醫(yī)學(xué)腎陽(yáng)虛證的現(xiàn)代研究概述[J].遼寧中醫(yī)雜志,2007,34(7):1014-1016.
[2]伍慶華,王建紅,祁風(fēng)義.腎陽(yáng)虛與下丘腦-垂體-靶腺軸研究概述[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,18(6):73-74.
[3]蘇友新.蛋白質(zhì)組學(xué)與中醫(yī)藥現(xiàn)代研究[J].福建中醫(yī)藥,2006,37(1):5-7.
[4]茍小軍,韓寶俠,王朝廷,等.腎陽(yáng)虛證造模方法考察[J].吉林中醫(yī)藥,2009,29(9):814-815.
[5]杜江,李楠,王和鳴.腎虛模型造模方法及相關(guān)指標(biāo)[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(50):9433-9436.
[6]ANTHARAVALLY B S,MALLIA K A,RANGARAJ P,et al. Quantitation of proteins using a dye-metal-b ased colorimetric protein assay[J].Anal Biochem,2009,385(2):342-345.
[7]STARITA-GERIBALDI M.Selection of pH ranges in 2DE[J]. Methods Mol Biol,2009(519):31-45.
[8]胡淼鋒,周曉成,單樂(lè)天,等.蛋白質(zhì)組學(xué)在股骨頭壞死中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)骨傷,2013,26(3),264-266.
[9]RAIN J C,SELIG L,DE REUSE H,et al.The protein-protein interaction map of Helicobacter pylori[J].Nature,2001,409(11):211-215.
[10]RINALDI F,SCHNEIDER G,KALJURAND K,et al.Mining of relations between proteins over biomedical scientific literature using a deep linguistic approach[J].Artific-ial Intelligence in Medicine.2007,39(2):127-136.
[11]杜武勛,朱明丹,姜民,等.生物系統(tǒng)論指導(dǎo)下的中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)研究及其問(wèn)題[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,31(3):419-422.
[12]李林.蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2000,27(3):227-231.
[13]金光亮.證候基因組學(xué)和證候蛋白質(zhì)組學(xué)淺論[J].中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào),2003,18(6):332-335.
[14]張子怡,陳寶軍,張英杰,等.腎陽(yáng)虛、腎陰虛證大鼠模型的建立與穩(wěn)定性觀察[J].福建中醫(yī)藥,2015,46(1):51-54.
R274
A
1000-338X(2015)06-0050-04
2015-10-05
國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273888)
王藝茹(1986—),女,碩士研究生。
蘇友新(1969—),男,醫(yī)學(xué)博士,教授,博士生導(dǎo)師。E-mail:suyouxin777@hotmail.com