王藝茹，王雯婷，李亞楠，陳寶軍，張英杰，詹正烜，鄭乃熙，黃露露，賴興泉，蘇友新（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122）

·實(shí)驗(yàn)研究·

腎陽(yáng)虛大鼠股骨皮質(zhì)骨差異蛋白質(zhì)表達(dá)分析

王藝茹，王雯婷，李亞楠，陳寶軍，張英杰，詹正烜，鄭乃熙，黃露露，賴興泉，蘇友新（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122）

目的比較分析腎陽(yáng)虛證模型大鼠與正常大鼠股骨皮質(zhì)骨差異表達(dá)蛋白質(zhì)，從骨組織功能蛋白質(zhì)角度初步探討腎陽(yáng)虛證的實(shí)質(zhì)。方法60只雄性WISTAR大鼠隨機(jī)分為正常組和腎陽(yáng)虛組，每組各30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。腎陽(yáng)虛組：臀部肌肉注射氫化可的松注射液2.5 mg／100 g，每日1次，自由飲水、飲食。正常組：自由飲食、飲水。注射造模干預(yù)15 d后繼續(xù)觀察3周。模型鑒定成功后分別獲取腎陽(yáng)虛組和正常組大鼠股骨皮質(zhì)骨標(biāo)本，進(jìn)行總蛋白的提取制備。采用雙向凝膠電泳（2-DE）技術(shù)展示2組大鼠的皮質(zhì)骨蛋白質(zhì)組圖譜，應(yīng)用PDQuest軟件分析2組間差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）初步鑒定差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。結(jié)果2組皮質(zhì)骨2-DE凝膠圖譜可辨別蛋白點(diǎn)數(shù)目為470個(gè)；與正常組比較，腎陽(yáng)虛組皮質(zhì)骨中存在12個(gè)已知的差異表達(dá)蛋白，其中載脂蛋白A-I、α烯醇化酶和熱休克蛋白60表達(dá)上調(diào)，原肌球蛋白異構(gòu)體2α-3鏈、I型膠原α-1鏈、GDP解離抑制因子β、LOC683667蛋白、白細(xì)胞酪氨酸激酶受體、線粒體ATP合酶亞基α、膜聯(lián)蛋白A3、丙酮酸激酶同工酶及蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3表達(dá)下調(diào)。結(jié)論股骨皮質(zhì)骨12個(gè)蛋白表達(dá)改變可能與腎陽(yáng)虛證的發(fā)生有關(guān)。

蛋白質(zhì)組學(xué)；腎陽(yáng)虛證；大鼠；骨組織；雙向電泳；質(zhì)譜

“腎主骨”是中醫(yī)的經(jīng)典理論之一，認(rèn)為“腎”與“骨”存在著密切聯(lián)系，“腎強(qiáng)則骨強(qiáng)、腎虛則骨弱”，腎虛可以導(dǎo)致骨病，如骨軟化、骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)增生、骨折愈合遲緩等。腎陰虛與腎陽(yáng)虛是腎虛證的基本證型，腎陽(yáng)虛證是由于素體陽(yáng)虛、年高腎虧、房勞過(guò)度或久病傷腎等，使腎陽(yáng)虧虛，機(jī)體失于溫煦所表現(xiàn)的一組證候，是中醫(yī)最常見(jiàn)的證候之一。對(duì)于腎陽(yáng)虛證的證候?qū)嵸|(zhì)，雖已取得一定的共識(shí)［1－2］，但至今它的發(fā)生機(jī)理還尚未完全清楚。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)學(xué)相關(guān)研究的廣泛應(yīng)用，目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到中醫(yī)“證”的實(shí)質(zhì)與疾病個(gè)體特定的功能蛋白質(zhì)組及其基因組的表達(dá)水平密切相關(guān)，疾病不同中醫(yī)證型區(qū)別的實(shí)質(zhì)是功能蛋白質(zhì)組及其基因組的表達(dá)水平差異［3］。所以，基于中醫(yī)“腎主骨”理論，本研究擬從骨組織功能蛋白質(zhì)表達(dá)水平差異的角度進(jìn)一步探索腎陽(yáng)虛證的實(shí)質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3月齡SPF級(jí)WISTAR大鼠60只，均為雄性，體重（210±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：2007000548 015。委托福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)及飼養(yǎng)。

1.2 主要藥物與試劑氫化可的松注射液（福州海王福藥制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：1209111）；大鼠環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）及環(huán)磷酸腺苷（cAMP）ELISA試劑盒購(gòu)自上海Westang Bio-tech有限公司；固相PH梯度膠條（17 cm，pH 4-7 NL）、二硫蘇糖醇、3-［（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基］-1-丙磺酸（CHAPS）、ReadyStrip IEF緩沖液（Bio-lyte）、礦物油（Mineral Oil）、碘乙酰胺（IAA）、分離膠緩沖液（1.5 M Tris Hcl，PH 8.8）、丙烯酰胺預(yù)混液（30%AcyBis）、四甲基乙二胺（TEMED）、過(guò)硫酸銨（AP）、封膠液（ReadyPrep Overlay Agarose）、甘氨酸（Glycine）、考馬斯亮藍(lán)染色液、尿素、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、蛋白定量試劑盒及Ready Prep 2-D Clean up Kit均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；硫脲、乙腈（ACN）、甘油、碳酸氫銨（Ammonium bicarbonate）、三氟乙酸（TFA）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TPCK-Trypsin胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Dnase、Rnase酶購(gòu)自北京TransGen公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；蛋白酶抑制劑Cocktail購(gòu)自上海Roche公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器64R高速低溫離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN公司）；PROTEAN IEF Cell等電聚焦系統(tǒng)、PowerPacTM Universal電泳儀、PROTEANⅡxi垂直板電泳系統(tǒng)和灌膠模具（美國(guó)Bio-Rad公司）；Image Scanner掃描儀（美國(guó)GE公司）；ELX808酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)BIO-TEK）；Milli-Q超純水儀（德國(guó)Millipore公司）；Autoflex speed質(zhì)譜儀（美國(guó)BRUKER公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為2組，即正常組、腎陽(yáng)虛組各30只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，腎陽(yáng)虛組大鼠予臀部肌肉注射氫化可的松注射液（2.5 mg／100 g），每日1次，自由飲水、飲食，連續(xù)15 d［4］。正常組大鼠給予自由飲食、飲水。

1.5 模型鑒定及標(biāo)本獲取注射造模后，繼續(xù)觀察3周，通過(guò)肉眼觀察大鼠活動(dòng)、反應(yīng)、弓背、毛色及飲食、飲水等情況，并測(cè)量大鼠體重與體溫（肛溫）及檢測(cè)大鼠血清cAMP、cGMP和cAMP／cGMP比值進(jìn)行模型的鑒定［5］。確定模型成功后，用10%水合氯醛以300 mg／kg的劑量腹腔注射麻醉所有大鼠，在冰上操作迅速取下其股骨干，剔除軟組織及骨膜部分，并用骨剪剪開(kāi)，用超純水將骨髓沖洗干凈，然后用刮匙將股骨干松質(zhì)骨輕輕刮除后放入5 mL的Eppendorf管中，標(biāo)記后置于液氮罐中，最后轉(zhuǎn)入－80℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 皮質(zhì)骨總蛋白提取與制備取股骨皮質(zhì)骨樣本1 g，放在盛有液氮的研缽里研磨粉碎后轉(zhuǎn)入EP管中，并加入1.5 mL樣品裂解液［7 mol／L尿素、2 mol／L硫脲、4%（W／V）CHAPS、1%（V／V）兩性電解質(zhì)載體、50 mmol／L DTT、20 mmol／L Tris、20 mmol／L PMSF］，于4℃冰箱中裂解提取蛋白質(zhì)4 h；然后置于低溫高速離心機(jī)以14 000 rpm離心30 min，吸取上清液；每1 mL裂解液加入2μL Dnase和2 μL Rnase，冰上放置15min；用超聲清洗儀超聲致液體不黏稠為止，然后4℃、14 000 rpm離心30 min，吸取上清液；2-D clean-up試劑盒按操作說(shuō)明書提純濃縮蛋白；Bradford法［6］測(cè)定蛋白濃度并計(jì)算上樣蛋白體積。

1.7 雙向凝膠電泳根據(jù)美國(guó)Bio-Rad公司的2-DE操作指南和相關(guān)文獻(xiàn)［7］進(jìn)行操作。第一向?yàn)镮EF電泳，本實(shí)驗(yàn)選用長(zhǎng)17 cm，pH為4～7的IPG預(yù)制膠條，膠條泡脹電壓為50 V 12 h，電泳參數(shù)設(shè)定：250 V 1 h、1 000 V 1 h、4 000 V 3 h、8 000 V 11 h、500 V維持。聚焦完成后進(jìn)行兩次膠條的平衡及潤(rùn)洗，然后進(jìn)行第二相SDS-PAGE電泳，起初恒壓100 V 40 min后，換用恒壓300 V 4.5 h，待示蹤溴酚藍(lán)跑至距凝膠底部約1 cm時(shí)停止電泳。

1.8 凝膠蛋白點(diǎn)染色及差異表達(dá)蛋白點(diǎn)靶定電泳結(jié)束后，輕輕撬開(kāi)兩層玻璃板，取出凝膠，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色過(guò)夜，然后用配好的脫色液進(jìn)行多次脫色，直至膠的背景清晰且蛋白點(diǎn)明顯，再用Image Scanner掃描儀獲取2-DE凝膠圖片；應(yīng)用PDQuest 8.0分析軟件進(jìn)行凝膠圖譜蛋白點(diǎn)檢測(cè)，并以蛋白點(diǎn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化體積變化達(dá)1.5倍以上為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的靶定。

1.9 質(zhì)譜分析樣品制備將檢定的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)從凝膠上手工切下，切成1 mm3大小置于1.5 mL EP管中；行脫色、脫水等處理后進(jìn)行胰蛋白酶酶解；酶解后取上清液移至另一新的0.5 mL EP管中，剩下的膠塊加入100μL萃取液（60%ACN，含0.1% TFA），超聲15 min，離心，合并上清液，凍干，待做質(zhì)譜分析。

1.10 質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)庫(kù)搜索完全凍干的樣品用0.1%TFA重溶，進(jìn)行質(zhì)譜分析。采用板上混合點(diǎn)樣的方法進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，然后應(yīng)用flex analysis軟件對(duì)獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析后的每一個(gè)樣品的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)再整合成一個(gè)文件，使用MASCOT（V3.2，Matrix Science，London，U.K）搜庫(kù)軟件進(jìn)行檢索，MASCOT蛋白質(zhì)顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為是可靠的鑒定結(jié)果。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS17.0軟件對(duì)2組大鼠測(cè)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)屬正態(tài)分布均以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.01為有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠一般狀態(tài)及環(huán)核苷酸系統(tǒng)比較造模后，腎陽(yáng)虛組大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、體毛枯疏并失去光澤、爪甲與耳朵顏色變淡、弓背蜷縮、喜扎堆等畏寒怕冷表現(xiàn)，采食量與飲水量減少，體溫及體重顯著下降（P＜0.01），見(jiàn)表1、表2。cAMP含量下降，cGMP含量升高，cAMP／cGMP比值降低，均有非常顯著性差異（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表1 2組大鼠體重比較（±s）g

表1 2組大鼠體重比較（±s）g

注：與正常組比較，1）P＜0.01。

造模后第2 1天3 7 1 . 9 0 ± 1 8 . 5 6 2 9 0 . 6 3 ± 1 4 . 5 91）組別正常組腎陽(yáng)虛組n 3 0 2 7造模前2 5 4 . 1 0 ± 1 4 . 6 9 2 5 3 . 9 3 ± 1 5 . 5 0造模第1 5天3 0 5 . 6 7 ± 1 8 . 3 5 2 6 7 . 4 8 ± 1 5 . 5 31）

表2 2組大鼠體溫比較（±s）℃

表2 2組大鼠體溫比較（±s）℃

注：與正常組比較，1）P＜0.01。

造模后第21天38.13±0.34 37.33±0.311）組別正常組腎陽(yáng)虛組n 30 27造模前38.12±0.30 38.11±0.39造模第15天38.13±0.33 37.17±0.371）

表3 造模后第21天2組大鼠cAMP、cGMP含量比較（±s）

表3 造模后第21天2組大鼠cAMP、cGMP含量比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01。

cAMP／cGMP 4.65±1.03 0.89±0.261）組別正常組腎陽(yáng)虛組n 5 5 cAMP／（pmol·mL-1）36.20±2.98 23.44±7.231）cGMP／（pmol·mL-1）8.00±1.33 26.18±1.621）

2.2 皮質(zhì)骨總蛋白雙向電泳圖譜及差異表達(dá)蛋白點(diǎn)標(biāo)識(shí)結(jié)果見(jiàn)圖1，經(jīng)過(guò)蛋白點(diǎn)檢測(cè)，2組凝膠圖譜可辨識(shí)的蛋白點(diǎn)數(shù)目均為470個(gè)。通過(guò)軟件對(duì)蛋白點(diǎn)的匹配分析并結(jié)合人工對(duì)比綜合判斷，檢測(cè)到12個(gè)明顯差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。以正常組為參考，其中點(diǎn)1207、4302、3105、3705、7006、8105、8305、7401、6800為下調(diào)表達(dá)，6104、4108、6706為上調(diào)表達(dá)。

2.3 差異表達(dá)蛋白的MAIDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定將明顯差異表達(dá)的12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠上手工切下，經(jīng)胰蛋白酶酶解消化后進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析。獲得的肽質(zhì)量指紋圖譜信號(hào)強(qiáng)且基線較平穩(wěn)，噪音低，適于進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。根據(jù)12個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)肽段的MS和MS／MS質(zhì)譜圖信息，使用MASCOT搜庫(kù)軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定，表4為質(zhì)譜鑒定的蛋白點(diǎn)相關(guān)信息，包括蛋白質(zhì)的編號(hào)、蛋白質(zhì)種類、分子量、等電點(diǎn)等。

圖1 股骨皮質(zhì)骨總蛋白雙向電泳圖譜及差異蛋白點(diǎn)標(biāo)識(shí)

表4 差異表達(dá)蛋白的MALDI-TOF-TOF／MS鑒定結(jié)果

2.4 差異表達(dá)蛋白相關(guān)功能的生物信息學(xué)檢索將質(zhì)譜鑒定確立的12種已知差異表達(dá)蛋白名稱輸入U(xiǎn)niProt及NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白相關(guān)功能的生物信息學(xué)檢索，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.5 腎陽(yáng)虛大鼠皮質(zhì)骨差異表達(dá)蛋白的種類根據(jù)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)標(biāo)識(shí)與質(zhì)譜鑒定結(jié)果得出：腎陽(yáng)虛大鼠股骨干皮質(zhì)骨中存在上調(diào)表達(dá)的蛋白3個(gè)，分別為載脂蛋白A-I、α烯醇化酶和熱休克蛋白60；下調(diào)表達(dá)的蛋白9個(gè)，分別為原肌球蛋白異構(gòu)體2α-3鏈、I型膠原α-1鏈、GDP解離抑制因子β、LOC683667蛋白、白細(xì)胞酪氨酸激酶受體、線粒體ATP合酶亞基α、膜聯(lián)蛋白A3、丙酮酸激酶同工酶及蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3。

3 討論

蛋白質(zhì)組的相關(guān)研究是后基因組研究的重要內(nèi)容［8］，它從整體上對(duì)細(xì)胞、組織或者有機(jī)體整體蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究與分析，從而在更深層面闡明生命的現(xiàn)象與本質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有高通量、橫向平行及動(dòng)態(tài)性等優(yōu)勢(shì)，可以研究健康或病理狀態(tài)下相同個(gè)體生命活動(dòng)規(guī)律所表現(xiàn)的總體蛋白質(zhì)的差異，借以闡明疾病機(jī)理、解釋藥物作用機(jī)制、鑒定疾病分子標(biāo)志物、揭示中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)等，且方法也不斷成熟與穩(wěn)定，是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究平臺(tái)［9－10］。腎陽(yáng)虛證的證候表現(xiàn)一定有其物質(zhì)基礎(chǔ)［11］，這個(gè)物質(zhì)基礎(chǔ)可能就是一組差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是生命征象（包括各種癥狀、體征的疾病癥候）的體現(xiàn)者，是執(zhí)行生命功能的載體［12－13］?！澳I主骨”是中醫(yī)“臟象”學(xué)說(shuō)的重要內(nèi)容之一，認(rèn)為骨的盛衰健壯與腎的功能密切相關(guān)，腎虛可以導(dǎo)致骨病，也就是說(shuō)骨組織的代謝變化與生化改變與“腎”功能狀態(tài)存在著對(duì)應(yīng)關(guān)系，那么骨組織的功能蛋白質(zhì)組表達(dá)水平與腎陽(yáng)虛證之間也必然存在著關(guān)聯(lián)性?；谝陨系恼J(rèn)識(shí)，本研究借助于蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)與方法，基于中醫(yī)“腎主骨”的理論，從大鼠股骨皮質(zhì)骨差異表達(dá)蛋白質(zhì)表達(dá)角度探討腎陽(yáng)虛證的部分實(shí)質(zhì)。

表5 蛋白質(zhì)相關(guān)功能的生物信息學(xué)檢索結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)肌注氫化可的松建立腎陽(yáng)虛證候模型大鼠，并采用大鼠相關(guān)狀態(tài)的觀察及血清環(huán)核苷酸系統(tǒng)的檢測(cè)對(duì)模型進(jìn)行鑒定。研究結(jié)果表明：腎陽(yáng)虛證模型大鼠的癥狀、體征和血清cAMP、cGMP含量檢測(cè)及cAMP／cGMP比值結(jié)果均符合腎陽(yáng)虛證模型的鑒定要求［14］，提示腎陽(yáng)虛模型造模是成功的。

通過(guò)對(duì)大鼠股骨皮質(zhì)骨蛋白質(zhì)組圖譜、差異表達(dá)蛋白點(diǎn)比較分析以及質(zhì)譜鑒定的結(jié)果分析表明：相對(duì)于正常組，腎陽(yáng)虛組股骨皮質(zhì)骨載脂蛋白AI、α烯醇化酶和熱休克蛋白60等3個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，原肌球蛋白異構(gòu)體2α-3鏈、I型膠原α-1鏈、GDP解離抑制因子β、LOC683667蛋白、白細(xì)胞酪氨酸激酶受體、線粒體ATP合酶亞基α、膜聯(lián)蛋白A3、丙酮酸激酶同工酶及蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3等9個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。這些差異的蛋白質(zhì)按功能可以大致分為4類：①催化類蛋白4個(gè)：如丙酮酸激酶同工酶、ATP合酶亞基α、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3、α烯醇化酶；②結(jié)構(gòu)及支架類蛋白質(zhì)2個(gè)：I型膠原α-1鏈、原肌球蛋白異構(gòu)體2α-3鏈；③轉(zhuǎn)運(yùn)類蛋白質(zhì)2個(gè)：LOC683667、載脂蛋白A-I；④調(diào)節(jié)類蛋白質(zhì)4個(gè)：膜聯(lián)蛋白A3、GDP解離抑制因子β、白細(xì)胞酪氨酸激酶受體、線粒體熱休克蛋白60。以上研究結(jié)果提示：上述12種蛋白的表達(dá)差異與腎陽(yáng)虛證的發(fā)生存在著密切聯(lián)系，這些蛋白質(zhì)表達(dá)異?？赡芡ㄟ^(guò)股骨干皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)構(gòu)成、化學(xué)反應(yīng)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、新陳代謝和細(xì)胞凋亡等方面的改變而影響腎陽(yáng)虛證的發(fā)生及出現(xiàn)各種癥候群。

本研究?jī)H初步比較并確認(rèn)正常大鼠與腎陽(yáng)虛證候模型大鼠中股骨皮質(zhì)骨的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，對(duì)它們的鑒定與驗(yàn)證有待于今后進(jìn)一步的研究。

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R274

A

1000-338X（2015）06-0050-04

2015-10-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81273888）

王藝茹（1986—），女，碩士研究生。

蘇友新（1969—），男，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：suyouxin777@hotmail.com