蘇艷麗，田 鵬，魏聞東

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 鄭州果樹(shù)研究所，河南 鄭州 450009）

紅星梨葉片不定梢誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)

蘇艷麗，田 鵬，魏聞東

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 鄭州果樹(shù)研究所，河南 鄭州 450009）

為了找到紅星梨葉片離體培養(yǎng)的最佳條件，從取材時(shí)間、暗培養(yǎng)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、不同繼代次數(shù)等方面研究其對(duì)紅星梨葉片再生的影響。結(jié)果表明：外植體取4月初的莖段較好，選用繼代2次植株的葉片，細(xì)胞分裂素BA比TDZ效果好，生長(zhǎng)素IBA比NAA效果好，暗培養(yǎng)30 d，適合葉片再生的培養(yǎng)基為NN69＋BA 5.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.3 mg/L，適合再生苗增殖的培養(yǎng)基為MS＋BA 1.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.2 mg/L＋GA 0.2 mg/L。

紅星梨；葉片；再生

紅星梨Pyrus communiscv. Starkrimson系鄭州果樹(shù)研究所1988年由新西蘭引入國(guó)內(nèi)的優(yōu)秀全紅色西洋梨品種，果實(shí)葫蘆形，外觀鮮紅艷麗，風(fēng)味獨(dú)特有香氣，肉質(zhì)柔軟多汁，風(fēng)味酸甜清香可口，目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)與市場(chǎng)上數(shù)量較少，價(jià)格較高，出口前景看好。穩(wěn)定高效的離體培養(yǎng)體系的建立是遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，雖然國(guó)內(nèi)有關(guān)梨離體快繁的報(bào)道較多，但有關(guān)紅星梨的組培研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文中主要研究了紅星梨葉片再生體系建立的幾個(gè)影響因子，旨在為紅星梨葉片高效離體再生體系建立和進(jìn)一步紅星梨遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

以鄭州果樹(shù)研究所梨育種試驗(yàn)圃里紅星梨的莖段為外植體進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基為MS＋BA 0.6 mg/L＋I(xiàn)BA 0.4 mg/L＋GA 0.2 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂5.5 g/L，pH值調(diào)至5.8，取繼代30 d的試管苗頂端未展開(kāi)葉片，垂直葉片中脈橫切3刀，遠(yuǎn)軸面向下，接種在葉片不定梢誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行葉片不定梢的誘導(dǎo)。

1.2 方 法

1.2.1 不同取材時(shí)間對(duì)葉片再生的影響

分別在3月中旬和4月初取紅星梨莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)不同時(shí)期的莖段誘導(dǎo)出的繼代苗葉片的再生率。

1.2.2 不同細(xì)胞分裂素和暗培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)對(duì)葉片再生的影響

分別暗培養(yǎng)20 d和暗培養(yǎng)30 d，以NN69為基本培養(yǎng)基，觀察不同細(xì)胞分裂素對(duì)葉片再生的影響，2個(gè)處理為：①BA 5.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；②TDZ 2.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L。

1.2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)葉片再生的影響

以NN69為基本培養(yǎng)基，采用4種不同的激素組合來(lái)研究不同培養(yǎng)基對(duì)葉片再生的影響，4個(gè)處理分別為：①BA 5.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L＋AgNO34.5 mg/L＋CH 300 mg/L；②BA 5.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L＋CH 300 mg/L；③BA 5.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L；④BA 5.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.3 mg/L。

1.2.4 不同繼代次數(shù)對(duì)葉片再生的影響

分別取繼代1次、繼代2次和繼代4次的葉片進(jìn)行再生培養(yǎng)，觀察不同繼代次數(shù)對(duì)葉片再生的影響。

1.2.5 不同細(xì)胞分裂素濃度對(duì)再生苗增殖的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，生長(zhǎng)素用IBA 0.2 mg/L，細(xì)胞分裂素BA設(shè)3個(gè)質(zhì)量濃度處理：0.5、1.0、1.5 mg/L，赤霉素GA用0.2 mg/L，觀察不同細(xì)胞分裂素質(zhì)量濃度下葉片的再生情況。

1.3 計(jì)算方法

再生頻率＝(再生不定芽葉塊數(shù)/接種葉塊數(shù))×100%；

平均每葉再生不定芽數(shù)＝再生不定芽總數(shù)/再生不定芽的葉塊數(shù)；

增殖頻率＝(增殖的不定芽數(shù)/增殖前不定芽總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同取材時(shí)間對(duì)葉片再生的影響

經(jīng)調(diào)查，3月份取材接種的1批，葉片再生頻率為30.5%，平均每葉再生梢數(shù)為2.6；4月份取材接種的1批，葉片再生頻率為67.6%，平均每葉再生梢數(shù)為1.7。經(jīng)方差分析，P＝0.000＜0.01，2次取材的再生頻率差異達(dá)極顯著，說(shuō)明不同時(shí)期的外植體對(duì)葉片再生頻率的影響很大。

2.2 不同細(xì)胞分裂素及暗培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)對(duì)葉片再生的影響

不同細(xì)胞分裂素和暗培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)對(duì)葉片再生的影響見(jiàn)表1。從表1可得出，暗培養(yǎng)20 d時(shí)，處理1的葉片再生率為22.2%，較處理2的葉片再生率14.3%提高了55.2%，經(jīng)T檢驗(yàn)，P＝0.006＜0.05，差異達(dá)顯著水平；暗培養(yǎng)30 d時(shí)，處理1的葉片再生率為30.77%，較處理2的葉片再生率21.43%提高了43.6%，經(jīng)T檢驗(yàn)，P＝0.006＜0.05，差異達(dá)顯著水平。說(shuō)明暗培養(yǎng)20 d與30 d，處理1的葉片再生率均比處理2高，且觀察發(fā)現(xiàn)處理1的葉片再生苗長(zhǎng)勢(shì)也比處理2好，處理2的葉片再生苗有大團(tuán)的白色愈傷，苗子簇狀，說(shuō)明紅星梨葉片再生時(shí)選用細(xì)胞分裂素BA比TDZ效果好。

表 1 不同細(xì)胞分裂素和暗培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)對(duì)葉片再生的影響Table 1 Effect of different cytokinins and dark culture duration on leaf regeneration

經(jīng)方差分析，不同細(xì)胞分裂素和暗培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)對(duì)紅星梨葉片再生率的影響均達(dá)極顯著水平，P＝0.000＜0.01。選用細(xì)胞分裂素BA時(shí)，暗培養(yǎng)20 d葉片再生率為22.2%，暗培養(yǎng)30 d葉片再生率為30.77%，再生率提高了38.6%，經(jīng)T檢驗(yàn)，P＝0.017＜0.05，差異達(dá)顯著水平；選用細(xì)胞分裂素TDZ時(shí)，暗培養(yǎng)20 d葉片再生率為14.3%，暗培養(yǎng)30 d葉片再生率為21.43%，再生率提高了49.9%，經(jīng)T檢驗(yàn)，P＝0.017＜0.05，差異達(dá)顯著水平。說(shuō)明紅星梨葉片再生時(shí)，暗培養(yǎng)30 d比暗培養(yǎng)20 d效果好。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)葉片再生的影響

不同培養(yǎng)基中葉片的再生率見(jiàn)表2。從表2可得出，處理1和處理2培養(yǎng)基中分別添加AgNO34.5 mg/L和CH 300 mg/L后，與處理3相比，葉片的再生頻率降低了，說(shuō)明這2種物質(zhì)對(duì)提高紅星梨葉片的再生頻率沒(méi)有作用。經(jīng)方差分析，4種不同的培養(yǎng)基，其得到的葉片再生頻率間差異極顯著，P＝0.000＜0.01，說(shuō)明不同生長(zhǎng)素對(duì)紅星梨葉片的再生頻率影響較大，生長(zhǎng)素用IBA比NAA效果好。

表 2 不同培養(yǎng)基的葉片再生率Table 2 Leaf regeneration frequencies in different media

2.4 不同繼代次數(shù)對(duì)葉片再生的影響

在NN69＋BA5.0mg/L＋I(xiàn)BA0.3mg/L培養(yǎng)基上，繼代1、2、4次葉片的再生率分別為33.3%、67.6%、3.7%?？梢钥闯觯^代2次的葉片再生率最高（見(jiàn)圖1），隨著繼代次數(shù)的增加葉片的再生率下降，因此葉片再生時(shí)最好選用繼代2次的葉片。

2.5 不同細(xì)胞分裂素濃度對(duì)再生苗增殖的影響

不同細(xì)胞分裂濃度下再生苗的增殖情況見(jiàn)表3。從表3可看出，隨著細(xì)胞分裂素BA質(zhì)量濃度的提高，再生苗的增殖率呈先升高又降低的趨勢(shì)，BA 1.0 mg/L時(shí)增殖率最高，達(dá)75%（見(jiàn)圖2），經(jīng)方差分析，各處理間增殖率的差異均達(dá)極顯著水平，P＝0.000＜0.01。選用BA1.0 mg/L時(shí)增殖的苗多、苗壯，表現(xiàn)最好，因此培養(yǎng)基MS＋BA 1.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.2 mg/L＋GA 0.2 mg/L可作為紅星梨葉片再生苗的增殖培養(yǎng)基，觀察發(fā)現(xiàn)，用此培養(yǎng)基繼續(xù)轉(zhuǎn)接增殖，增殖效果越來(lái)越好，增殖系數(shù)可達(dá)3.96。

表 3 不同細(xì)胞分裂素濃度下再生苗的增殖情況Table 3 Proliferation status of regeneration seedlings under different concentrations of cytokinins

圖 2 葉片再生梢增殖Fig. 2 Proliferation of regenerated shoots from leaves

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)取材時(shí)間、不同細(xì)胞分裂素和暗培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)、不同添加物質(zhì)、不同繼代次數(shù)等方面對(duì)紅星梨葉片再生的影響進(jìn)行研究，得出紅星梨葉片再生可用4月初的莖段為外植體，選用繼代第2次植株中上部的葉片，葉片再生合適的培養(yǎng)基為NN69＋BA 5.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.3 mg/L，暗培養(yǎng)30 d；適合再生芽增殖的培養(yǎng)基為MS＋BA 1.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.2 mg/L＋GA 0.2 mg/L，增殖系數(shù)可達(dá)3.96。

不同時(shí)期的外植體對(duì)葉片再生的影響顯著。進(jìn)行紅星梨葉片再生培養(yǎng)時(shí)，用莖段作外植體，4月初的莖段較3月中旬的莖段繼代苗葉片再生率高。紅星梨繼代2次的葉片再生率最高，隨著繼代次數(shù)的增加葉片的再生率下降。湯紹虎等[1]對(duì)雪青梨的研究中也得出相同的結(jié)論。

培養(yǎng)環(huán)境也對(duì)葉片再生產(chǎn)生十分重要的影響。一般暗培養(yǎng)20～30 d有利葉片不定芽的再生[2-5]。本研究結(jié)果表明，不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紅星梨葉片再生效果影響顯著，以暗培養(yǎng)30 d為最佳。

培養(yǎng)基中添加AgNO3能促進(jìn)梨不定芽再生，但在不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)配比上，最適AgNO3濃度不同[5-7]。CH 100 mg/L[1]能夠明顯促進(jìn)雪青梨不定梢的分化。本文中研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加AgNO34.5 mg/L和CH 300 mg/L對(duì)提高紅星梨葉片的再生頻率沒(méi)有作用，可能是添加的濃度不合適。

葉片的不定梢再生受多種因素的影響，基因型是最重要的影響因素，基本培養(yǎng)基影響不定梢能否再生，植物生長(zhǎng)物質(zhì)影響不定梢再生率，3個(gè)因素適當(dāng)配合才能獲得最佳的再生效果[2]。已有研究表明[2,5,7-10]，在NN69基本培養(yǎng)基上能高效再生出不定芽，本試驗(yàn)中紅星梨能在NN69基本培養(yǎng)基上再生出不定芽，但再生率不高，可能是沒(méi)有找到最佳的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比。關(guān)于BA、TDZ使用效果的比較，報(bào)道不盡一致[1-4,7,11-12]，本研究結(jié)果表明，紅星梨的葉片再生，細(xì)胞分裂素BA比TDZ再生效果好，生長(zhǎng)素IBA比NAA效果好，與孫清榮等[2]認(rèn)為基本培養(yǎng)基為NN69，細(xì)胞分裂素為BA時(shí)，NAA比IBA更有利于西洋梨葉片再生的結(jié)論不同。本研究中紅星梨的葉片再生率滿足不了進(jìn)一步建立遺傳轉(zhuǎn)化體系的要求，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的最佳配比還有待繼續(xù)研究。

另外，再生葉片的選擇和處理[2,5,7,13]及不同的接種方式[2,5,13]對(duì)葉片再生率的影響也不同，采用展開(kāi)的葉片或其它接種方式是否能提高紅星梨葉片再生率有待進(jìn)一步研究。

[1]湯紹虎,孫 敏,周啟貴,等.雪青梨葉片高頻再生體系的建立[J].園藝學(xué)報(bào),2005,(6)：1084－1087.

[2]孫清榮,劉慶忠,趙紅軍,等.影響梨葉片高頻不定梢再生因素的研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2004,(8)：99－100,107.

[3]Caboni E, Tonelli M G, Lauri P, et al. In vitro shoot regeneration from leaves of wild pear [J].Plant Cell, Tissue and Organ Culture,1999, 59(1)： 1 － 7.

[4]趙竑博,徐凌飛.碭山酥梨葉片培養(yǎng)和植株再生[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) ,2007,16(2)：153－ 157.

[5]周莉莉,蔡斌華,喬玉山.不同處理對(duì)豐水梨離體葉片不定芽再生的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,30(2)：34－38.

[6]孫清榮,孫洪雁,鄭紅軍.乙烯抑制劑AgNO3對(duì)梨葉片再生不定梢的促進(jìn)作用[J].落葉果樹(shù),1998,(4)：1－2.

[7]劉翠瓊,湯浩茹,羅 婭.不同基因型梨葉片離體培養(yǎng)和植株再生[J].園藝學(xué)報(bào),2005,32(6)：1080－1083.

[8]韓繼成,馮志紅,陳霜瑩.梨離體葉片誘導(dǎo)不定芽的研究[J].河北果樹(shù) ,2001,(2)：12.

[9]徐凌飛,馬鋒旺,王喆之,等.八月紅梨葉片不定芽誘導(dǎo)研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào),2002,30(4)：73－75.

[10]曾艷玲,譚曉風(fēng),烏云塔娜.自交新高梨葉片的培養(yǎng)繁殖技術(shù)[J].中南林學(xué)院學(xué)報(bào),2005,25(4)：50－53.

[11]Pawlicki N, welander Jork. Adventitious shoot regeneration from leaf segment s of in vitro cultured shoots of the apple root stock[J]. Hort Sci, 1999,107：657 － 660.

[12]Zhu L H, Welander M. Adventitious shoot regeneration of two dwarfing pear root stocks and the development of a transformation protocol[J]. Hort Sci,2000,75(6)：745 － 752.

[13]陶愛(ài)群,尹 婷,謝深喜.黃金梨葉片再生體系建立研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,(5)：108－111.

Induction and proliferation culture of adventitious shoots fromPyrus communisleaves

SU Yan-li, TIAN Peng, WEI Wen-dong
(Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science, Zhengzhou 450009, Henan, China)

In order to find the best conditions of leaves in vitro culture, effects of sampling time, dark culture, plant growth regulators and subculture times on leaf regeneration inPyrus communiswere researched. The results showed that,the best explants were the stem segments in early April, it had best effect that leaves subcultured for two times were dark cultured for 30 days, BA had better effects than TDZ, and IBA had better effect than NAA. Suitable culture medium for leaf regeneration was NN69＋BA 5.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.3 mg/L, and suitable culture medium for regeneration seedling multiplication was MS＋BA 1.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.2 mg/L＋GA 0.2 mg/L.

Pyrus communis; leaf; regeneration

S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003—8981(2015)01—0103—04

2014-06-18

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（082102150011）；河南省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（092101110400）。

蘇艷麗，助理研究員，碩士。E-mail：suyanli@caas.cn

蘇艷麗,田 鵬,魏聞東.紅星梨葉片不定梢誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2015,33(1)：103－106.

[本文編校：聞 麗]