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        用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化錐栗總黃酮超聲提取工藝

        2015-12-21 01:00:57牛廣俊蘇素嬌陳詩(shī)強(qiáng)梁一池
        經(jīng)濟(jì)林研究 2015年1期
        關(guān)鍵詞:錐栗星點(diǎn)面法

        朱 思,牛廣俊,蘇素嬌,李 娜,陳詩(shī)強(qiáng),陳 亮,梁一池

        (福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122)

        用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化錐栗總黃酮超聲提取工藝

        朱 思,牛廣俊,蘇素嬌,李 娜,陳詩(shī)強(qiáng),陳 亮,梁一池

        (福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122)

        為了優(yōu)選錐栗中總黃酮的超聲提取工藝條件,以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液固比為試驗(yàn)因素,以錐栗總黃酮的提取率為考察指標(biāo),在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法(CCD-RSM),對(duì)錐栗總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果表明,錐栗總黃酮的最佳提取工藝條件為:80%乙醇,超聲提取20 min,固液比為24,提取溫度為50 ℃。按此工藝提取,總黃酮的提取率為0.0685%;且此方法操作簡(jiǎn)便,結(jié)果穩(wěn)定,預(yù)測(cè)性良好。

        錐栗;星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法;總黃酮;超聲提取

        錐栗Castanea henryi為殼斗科栗屬植物,又名珍珠栗,尖栗等[1],主要分布于閩北及浙南山區(qū)等地。唐朝孫思邈的《千金要方》中云:“栗子,味咸溫?zé)o毒,益氣厚腸胃,補(bǔ)腎氣,令人耐肌,生食之,甚治腰腳不遂。”《本草綱目》中記載:栗,腎之果也,栗能通腎,益氣溫胃,久食必強(qiáng)健。錐栗中所含的黃酮類化合物具有良好的抗氧化[2]、降脂、抗心律失常等功用[3]。為了優(yōu)選錐栗中總黃酮的超聲提取工藝條件,利用紫外-可見分光光度法,采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法,對(duì)錐栗中總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn),CCDRSM可以克服均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果不夠精確、數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性較差的弱點(diǎn),可以獲得更高的提取率。

        1 材料與方法

        1.1 材料、儀器與試劑

        供試錐栗為建甌‘八月香’品種,經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院梁一池教授鑒定,其為殼斗科栗屬錐栗的成熟種子。將錐栗去殼及種皮,種仁于40 ℃下干燥至恒重,粉碎,過40目篩,置于干燥器中以備用。

        UV-9100紫外可見分光光度計(jì),北京瑞利分析儀器公司;TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;THC-10B數(shù)控超聲波提取器,濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司;AR2130電子天平,上海奧豪斯儀器有限公司;蘆丁對(duì)照品,成都曼思特生物科技有限公司,純度≥98%,批號(hào)為MUST-12040302。水為蒸餾水,其他試劑均為分析純。

        1.2 方 法

        對(duì)照品溶液的制備:精密稱取蘆丁對(duì)照品4 mg,置于10 mL的量瓶中,加入70%乙醇溶解,并定容至刻度,搖勻,然后置于冰箱中冷藏以備用。

        供試品溶液的制備:精密稱取錐栗粉末約1 g,置于100 mL的錐形瓶中,量取60%乙醇10 mL,稱定重量,浸泡30 min后,于50 ℃下超聲提取30 min,放至室溫后稱重,補(bǔ)足失重,離心,取上清液,即得。

        最大吸收波長(zhǎng)的確定[4]:精密量取上述蘆丁對(duì)照品溶液1 mL,置于10 mL的量瓶中,加入70%乙醇2.4 mL,加入5%的亞硝酸鈉溶液0.4 mL,搖勻,放置6 min后,加入10%的硝酸鋁溶液0.4 mL,搖勻,放置6 min后,再加入4%的氫氧化鈉4 mL,加入70%的乙醇至刻度,搖勻,放置15 min后,以相應(yīng)試劑為空白,于200~800 nm處掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在510 nm處有最大吸收量,因而確定510 nm為測(cè)定的波長(zhǎng)。

        標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[5]:分別移取2.1所述對(duì)照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 于8個(gè)10 mL的量瓶中,加入70%的乙醇2.4 mL,加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL,搖勻,放置6 min后加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL,搖勻,放置6 min后加入4%氫氧化鈉4 mL,加入70%乙醇至刻度,搖勻,15 min后于510 nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定,以相應(yīng)試劑為空白,以對(duì)照品濃度X(mg·mL-1)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),得到如下線性回歸方程:

        A=11.659X+0.0106(r=0.9993,線性范圍為0.008~0.064 mg·mL-1)。

        星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn):在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)[6],以對(duì)總黃酮提取率影響較顯著的乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、提取時(shí)間(X2)、固液比(X3)為自變量,以錐栗總黃酮提取率為因變量[7]。考慮到提取次數(shù)為非連續(xù)變量,結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際,暫定為1次。試驗(yàn)因素與水平見表1。

        表 1 錐栗中總黃酮超聲提取工藝星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of the central composite design test of total flavonoids extraction in C. henryi nuts

        2 結(jié)果與分析

        2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

        精密度試驗(yàn)結(jié)果:連續(xù)6次測(cè)定同一對(duì)照品溶液,其吸光度的平均值為0.401,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.417%,說明測(cè)定方法的精密度良好。

        穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果:取供試品溶液1份,顯色15 min后,每隔5 min測(cè)定吸光度,在30 min的測(cè)定時(shí)間內(nèi),吸光度的平均值為0.391,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.49%,表明供試品溶液在30 min內(nèi)顯色穩(wěn)定。

        重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果:取錐栗粉末6份,按照1.2中的“供試品溶液的制備”及“最大吸收波長(zhǎng)的確定”方法進(jìn)行處理,于510 nm處測(cè)定吸光度并計(jì)算總黃酮提取率,總黃酮平均提取率為0.046%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.74%,表明方法的重復(fù)性良好。

        加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果:取已知含量的錐栗粉末6份,每份約0.5 g,精密稱定,分別置于錐形瓶中,各加入蘆丁對(duì)照品溶液(0.243 mg·mL-1)1 mL,按1.2中的“供試品溶液的制備”及“最大吸收波長(zhǎng)的確定”方法處理,于510 nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表2,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.98%,表明提取方法回收率良好。

        2.2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

        取錐栗粉末約1 g,精密稱定,按表3中的試驗(yàn)號(hào)進(jìn)行提取,按照上述測(cè)定方法測(cè)定錐栗中總黃酮的含量,結(jié)果見表3。

        表 2 總黃酮加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of total flavonoids recovery test

        表 3 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Scheme and result of the central composite design test

        應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸與方差分析,對(duì)各試驗(yàn)因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合[8]。

        多元線性回歸方程為:

        Y= 1.34×10-2+ 5.68×10-4X1- 3.549×10-5X2+ 2.894 95×10-4X3,r= 0.849 0。

        二項(xiàng)式擬合方程為:

        Y=- 3.79×10-4+ 3.47×10-4X1+ 5.56×10-4X2+ 9.96×10-4X3- 3.55×10-6X1X2- 1.17×10-5X1X3- 1.43×10-5X2X3+ 4.72×10-6X12-1.67×10-6X22+ 1.98×10-5X3

        2,r=0.946 7。分析上述方程可知,多元線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)較低(r=0.849 0),表明自變量和因變量之間的線性關(guān)系較差,擬合優(yōu)度不佳,預(yù)測(cè)性不及二項(xiàng)式擬合的結(jié)果,因此該數(shù)學(xué)模型不合適,宜采用二項(xiàng)式擬合,結(jié)果見表4。

        表 4 回歸模型分析結(jié)果?Table 4 Analysis result of regression models

        由表4中的P值可知,其中一次項(xiàng)X1為極顯著,X3和交互項(xiàng)X2X3為顯著水平,二次項(xiàng)和其他項(xiàng)均為不顯著。模型為極顯著水平,失擬項(xiàng)P>0.05,表明模型因噪音干擾所致的機(jī)率較小,二項(xiàng)式擬合模型為成功擬合模型。

        2.3 工藝參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果

        根據(jù)擬合的二次多項(xiàng)式方程,繪制總黃酮提取率隨各因素的影響而變化的效應(yīng)面圖,結(jié)果如圖1~3所示??傸S酮提取率最大值為0.0685%,最佳提取工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,提取時(shí)間為20 min,固液比為24。

        圖 1 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響效應(yīng)面圖Fig. 1 Response surface curve to effect of ethanol volume fraction and extraction time on extraction rate of total fl avonoids

        圖 2 乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比對(duì)總黃酮提取率的影響效應(yīng)面圖Fig. 2 Response surface curve to effect of ethanol volume fraction and solid-liquid ratio on extraction rate of total fl avonoids

        圖 3 提取時(shí)間和固液比對(duì)總黃酮提取率的影響效應(yīng)面圖Fig. 3 Response surface curve to effect of extraction time and solid-liquid ratio on extraction rate of total fl avonoids

        2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

        根據(jù)最佳工藝條件提取并測(cè)定錐栗中總黃酮的含量,3組平行試驗(yàn)的平均提取率為0.0673%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.15%,實(shí)際值與預(yù)測(cè)值間的偏差率為-1.08%,這表明采用優(yōu)化得到的工藝條件進(jìn)行提取,可以獲得較高的總黃酮提取率。

        3 討 論

        憑借較好的試驗(yàn)精度和可分析的各個(gè)因素之間的相互作用,星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法在藥學(xué)領(lǐng)域的運(yùn)用越來越廣泛,采用這種方法的試驗(yàn)次數(shù)比正交設(shè)計(jì)法有所減少,這樣既節(jié)省了時(shí)間又節(jié)約了資源[9]。本試驗(yàn)因總黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而持續(xù)增加,故效應(yīng)面的曲面弧度較小,因而在實(shí)驗(yàn)中選取對(duì)因變量影響較顯著的因素,效應(yīng)面弧度將變大。

        錐栗為藥食兩用的佳品,目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其生理生化、良種繁育[10]、生態(tài)、栽培[11]、病蟲害、加工等方面的研究報(bào)道較多[12],而對(duì)其保健方面的研究報(bào)道卻較少。本試驗(yàn)對(duì)其總黃酮的提取工藝進(jìn)行探討,旨在為錐栗的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

        [1]楊利民.植物資源學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2008:173.

        [2]鄭誠(chéng)樂,許偉東,潘東明,等.正交試驗(yàn)法測(cè)定錐栗總黃酮含量技術(shù)研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,25(1):128-131.

        [3]李姣娟,戴 瑜.川桂葉總黃酮對(duì)油脂抗氧化作用的研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(10):134-137.

        [4]謝 臻,陳 勇,曾海生,等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選地桃花中總黃酮的提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(12):27-30.

        [5]王婧杰,馬鳳鳴,穆立薔.用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取紫椴枝皮中的黃酮[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2012,30(4):113-118.

        [6]喻林華,方 晰.正交試驗(yàn)優(yōu)選薄荷總黃酮超聲提取工藝研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(8):94-97.

        [7]梁 雪,楊越冬.用加壓溶劑萃取法提取板栗多糖的工藝條件[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2013,31(3):98-102.

        [8]劉常青,謝友良,賴小平.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選青天葵總黃酮提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(12):24-27.

        [9]劉艷杰,項(xiàng)榮武.星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法在藥學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2007,24(6):455-457.

        [10]梁一池.錐栗數(shù)量性狀遺傳參數(shù)分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究,1995,13(3): 25 - 28.

        [11]梁一池.錐栗無性系多性狀綜合選擇的研究[J].中南林學(xué)院學(xué)報(bào) ,1996,16(1):50 - 55.

        [12]馮金玲,楊志堅(jiān),陳 輝.錐栗的研究進(jìn)展[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究 ,2009,5(4):237 - 241.

        Optimization of total fl avonoids extraction process inCastanea henryinuts by central composite design and response surface method

        ZHU Si, NIU Guang-jun, SU Su-jiao, LI Na, CHEN Shi-qiang, CHEN Liang, LIANG Yi-chi
        (College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian, China)

        To optimize extraction process of total flavoniods inCastanea henryinut, taking ethanol volume fraction,extraction time and liquid-solid ratio as factors, and extraction rate of total flavoniods as a selection index, based on results of single factor tests, extraction process of total fl avoniods inC. henryinut was optimized by central composite design and response surface method. The results showed that the optimum conditions were extracting for 20 min at 50 ℃with 80% ethanol, solid-liquid ratio was 24, and extraction rate of total fl avoniods was 0.0685%. The method was simple and stable, and had good predictability.

        Castanea henryi; central composite design and response surface method; total flavonoids; supersonic extraction

        S609.9;S792.17 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1003—8981(2015)01—0127—04

        2014-03-09

        福建省第四期林木種苗重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目“錐栗優(yōu)良種質(zhì)評(píng)選與應(yīng)用研究”(閩林科〔2013〕1號(hào))。

        朱 思,碩士研究生。

        梁一池,教授。E-mail:fafulyc@126.com

        朱 思,牛廣俊,蘇素嬌,等.用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化錐栗總黃酮超聲提取工藝[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2015,33(1):127-130.

        [本文編校:伍敏濤]

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