劉傳淵　夏來陽△　張磊　王建　賴志華

(1 贛州市人民醫(yī)院普外一科　江西贛州　341600；2 贛州市人民醫(yī)院病理科)

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HER2和HER3在結(jié)直腸癌中的表達及其臨床意義*

劉傳淵1夏來陽1△張磊1王建2賴志華1

(1 贛州市人民醫(yī)院普外一科江西贛州341600；2 贛州市人民醫(yī)院病理科)

[摘要]目的探討HER-2和HER-3在結(jié)直腸癌中的表達及二者之間的相關(guān)性，及其臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)Envision二步法檢測100例患者結(jié)直腸癌組織、20例正常癌旁組織中HER-2和HER-3的表達，分析HER-2、HER-3表達水平與臨床病理因素間的關(guān)系及兩者之間的相關(guān)性。結(jié)果HER-2蛋白在正常癌旁組織、結(jié)直腸癌中的表達率分別為0%、4%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，HER-3蛋白在正常癌旁組織、結(jié)直腸癌中的表達率分別為0%、42%，差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；結(jié)直腸癌組織中HER-2蛋白表達與病理特點間無相關(guān)性，而HER-3蛋白表達與脈管癌栓、術(shù)前CEA值有關(guān)(P<0.05)；HER-2、HER-3在結(jié)直腸癌中的表達未見相關(guān)性。結(jié)論HER-2蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達率低，在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用可能很?。籋ER-3蛋白與脈管內(nèi)癌栓、術(shù)前較高的CEA值有關(guān)，可能預(yù)示著病程較晚，與結(jié)直腸癌的遷徙、轉(zhuǎn)移有關(guān)，HER-3有可能成為結(jié)直腸癌靶向治療中的重要靶點。

[關(guān)鍵詞]結(jié)直腸癌；HER-2；HER-3;免疫組織化學(xué)

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，已嚴重威脅人類的健康。2010年2月，歐盟藥品管理局批準曲妥珠單抗用于治療HER-2陽性轉(zhuǎn)移性胃或胃食管結(jié)合部癌。2011年，衛(wèi)生部公布的《胃癌臨床診療規(guī)范》推薦，HER-2陽性胃癌患者可考慮在化療的基礎(chǔ)上，聯(lián)合使用分子靶向治療藥物曲妥珠單抗(建議予檢測HER-2)。對于HER-2及其家族成員在結(jié)直腸癌中的表達及其與臨床病理間的關(guān)系，存在較大爭議。在HER家族中，HER-2、HER-3關(guān)系密切，形成的異源二聚體是強有力的信號復(fù)合體，那么二者在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中作用怎樣? 是否具相關(guān)性?本研究就HER-2、HER-3在結(jié)直腸癌中的表達及其相關(guān)性進行研究。

1材料和方法

1.1一般資料收集2013年1月至2014年6月我院普通外科結(jié)直腸專業(yè)組行根治性手術(shù)的結(jié)直腸癌存檔蠟塊100例，排除術(shù)前行輔助放、化療的患者。其中男52例，女48例，中位年齡62歲(25～80歲)，結(jié)腸癌49例、直腸癌51例。同時收集患者的臨床資料，包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、浸潤層次、組織分化及脈管內(nèi)癌栓等。另取20例癌旁正常黏膜組織作為對照組。全部標本病理診斷經(jīng)兩名以上病理醫(yī)師確認。

1.2免疫組織化學(xué)染色鼠抗人單克隆HER2抗體(克隆號 MAB-0198)購自福建邁新公司，兔抗人單克隆HER3抗體(克隆號SP71-ab93739)購自Abcam香港有限公司。Envision反應(yīng)液購自福建邁新公司。一抗工作濃度均為1∶100。采用Envision二步法: 組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度酒精至水。高壓修復(fù)抗原,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS 洗3次×3 min,滴加相應(yīng)稀釋的一抗4℃放置過夜。PBS洗3次×3 min,滴加Envision反應(yīng)液,室溫下溫育30 min,PBS洗滌3次。DAB顯色，流水洗，蘇木素襯染，鹽酸酒精分化，藍化。遞增梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)樹脂封片。實驗同時設(shè)陰性對照(以PBS代替一抗)和陽性對照( HER-2以已知陽性的乳腺癌標本作對照, HER-3以已知陽性的腎癌標本作對照。

1.3結(jié)果判定Her-2定位于細胞膜，染色判讀及評分標準參照2011版胃癌Her-2檢測指南[1]。(0)：不染色或<10%的腫瘤細胞胞膜染色；(1+)：>10%的腫瘤細胞微弱或隱約可見胞膜染色，或僅有部分胞膜染色；(2+)：>10%的腫瘤細胞弱到中度胞膜染色；(3+)：>10%的腫瘤細胞胞膜強染色。Her-3定位于細胞質(zhì)中，評分參考Her-2。(0)：不染色或<10%的腫瘤細胞胞質(zhì)染色；(1+)：>10%的腫瘤細胞微弱或隱約可見胞質(zhì)染色，或僅有部分胞質(zhì)染色；(2+)：>10%的腫瘤細胞弱到中度胞質(zhì)染色；(3+)：>10%的腫瘤細胞胞質(zhì)強染色。每位患者的結(jié)果均由2位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師評估。(0)和(1+)定義為低表達(陰性表達),(2+)及(3+)定義為高表達(陽性表達)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行，采用卡方檢驗、四格表Fisher’s確切概率法和非參數(shù)相關(guān)性分析(Spearman相關(guān)分析)，均以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1正常結(jié)直腸癌旁組織、結(jié)直腸癌組織中HER-2、HER-3表達情況見表1。在100例結(jié)直腸腸癌中，2例HER-2表達為(1+)，4例HER-2表達(2+)，HER-2蛋白高表達率4%，均為細胞膜表達(圖1)。20例正常癌旁組織未見HER-2表達。二者HER-2蛋白表達率差異無顯著性(P>0.05，表1)。HER-3蛋白主要表達于癌組織上皮細胞的胞質(zhì)中(圖2)。100例結(jié)直腸癌組織中42例存在HER-3高表達，20例正常癌旁組織未見HER-3表達，二者HER-3蛋白表達率差異具顯著性(P<0.05，表2)。

表1　正常結(jié)直腸癌旁組織、結(jié)直腸癌組織中HER-2表達情況

表2　正常結(jié)直腸癌旁組織、結(jié)直腸癌組織中HER-3表達情況

圖1　HER-2染色陽性(Envision法×100)

圖2HER-3染色陽性(Envision法×100)

2.2結(jié)直腸癌組織中HER-2、HER-3表達情況與臨床病理特征間關(guān)系HER-2高表達病例的臨床病理特點顯示，4例高表達者均為TNM分期Ⅱ期或Ⅲ期中分化腺癌病例。因陽性率過低，未發(fā)現(xiàn)其表達與腫瘤病理特點間呈相關(guān)性。HER-3在結(jié)直腸癌組織中的表達程度與脈管內(nèi)癌栓、術(shù)前CEA值有關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤部位及大小、腫瘤大體、組織分化、病理類型、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、術(shù)前CA199無關(guān)(表3)。

2.3結(jié)直腸癌組織中HER-2、HER-3表達的相關(guān)性經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析顯示: HER-2蛋白表達與HER-3蛋白表達之間未見相關(guān)性(r=0.118，P=0.242，表4)。

表3　100例結(jié)直腸癌患者Her-3表達與臨床病理資料間單因素分析[n(%)]

表4　結(jié)直腸癌組織中HER-2、HER-3表達的相關(guān)性

注：r=0.118，P=0.242

3討論

人表皮生長因子受體2(HER-2)是酪氨酸激酶受體家族的成員之一。具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，對細胞和組織的增生、分化起一定調(diào)控作用。當受到體內(nèi)外某些因素作用后，其結(jié)構(gòu)或表達調(diào)控失常從而被激活，參與腫瘤轉(zhuǎn)化。在乳腺癌、胃癌的治療中，抗 HER-2治療策略已經(jīng)相當完善。但對HER-2在結(jié)直腸癌中的作用報道差別較大。本研究發(fā)現(xiàn)，僅有4例標本HER-2蛋白存在高表達(4%)，與最近國外一些文獻報道HER-2在結(jié)直腸癌中表達低相符，但也有文獻報道HER-2蛋白表達率很高。究其原因可能與研究病例的數(shù)量、實驗方法、檢測技術(shù)、所用試劑，以及結(jié)果判斷標準的不同有關(guān)。Ingold等[2]予免疫組織化學(xué)對1645 例原發(fā)性結(jié)直腸癌患者進行HER-2檢測，發(fā)現(xiàn)僅 1.6% 為 HER-2表達陽性。HER2陽性與 UICC 分期高和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，HER-2陽性的結(jié)直腸癌患者表現(xiàn)出生存預(yù)后較差的趨勢。Marx等[3]研究發(fā)現(xiàn)在2.7%的結(jié)直腸癌中存在HER-2高表達，且與腫瘤位置、組織類型、pT、pN、pM分期及術(shù)后生存無關(guān)。Tu等[4]研究發(fā)現(xiàn)HER-2在結(jié)直腸癌中過表達率在11.6%(102/878)，且與臨床病理特征及預(yù)后無關(guān)。Kavanagh等[5]研究發(fā)現(xiàn)HER-2蛋白在結(jié)直腸癌中存在過表達，表達率為11%，且與年齡、性別、腫瘤分化程度、TNM分期，復(fù)發(fā)時間及5年生存率無關(guān)。但Park等[6]的研究證實，HER-2在結(jié)直腸癌中存在過度表達(47.4% 65/137)，且與患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高，3年、5年生存期縮短明顯相關(guān)，HER-2基因的過度表達是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立危險因素。本研究由于HER-2表達率過低，未發(fā)現(xiàn)HER-2的表達與臨床病理特點間關(guān)系。HER-2表達與結(jié)直腸癌的關(guān)系尚有爭論。

HER-3在肺癌，乳腺癌，卵巢癌、胃癌和結(jié)直腸癌中存在不同表達水平[7]。Ocana等[8]對12個研究進行META-分析發(fā)現(xiàn)HER-3的表達與實體腫瘤預(yù)后差明顯相關(guān)。Ho-Pun-Cheung 等[9]對100例局部晚期直腸癌病例進行分析，發(fā)現(xiàn)HER-3是預(yù)測直腸癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的獨立危險因素。本研究發(fā)現(xiàn)HER-3在結(jié)直腸癌組織中42%存在高表達，與脈管內(nèi)癌栓、術(shù)前CEA值有關(guān)。這與近期發(fā)表的一些文獻相符。Baiocchi等[10]報道HER-3在結(jié)直腸癌中的表達率為69.7%，與淋巴管浸潤相關(guān)，且是術(shù)后復(fù)發(fā)、生存的獨立影響因素。腫瘤生長到一定程度，分泌某些淋巴管生長因子，在腫瘤周圍或內(nèi)部形成新生淋巴管，腫瘤細胞侵入管腔并通過淋巴液順次流入各站淋巴結(jié)，脈管內(nèi)癌栓預(yù)示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[11、12]。CEA 是一種癌胚胎來源的糖蛋白，其可以作為抗原引起患者的免疫反應(yīng)；CEA 在多種腺癌細胞中有表達，特別在結(jié)直腸癌細胞中常出現(xiàn)高表達。術(shù)前CEA水平與淋巴結(jié)浸潤或遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，術(shù)前CEA高水平，往往預(yù)示病程較晚[13、14]。本研究中，發(fā)現(xiàn)在HER-3高表達組中，CEA高水平患者(46.34%)明顯多于HER-3低表達組(22.41%)，P=0.012。這也間接說明HER-3高表達可能預(yù)示病程較晚期。HER-3與各臨床病理因素之間有如此緊密的聯(lián)系，其主要原因可能與HER-3羧基末端的酪氨酸磷酸化位點遠多于其他HER家族成員有關(guān)，其6個具有協(xié)同作用的位點可同時與磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)調(diào)節(jié)亞基相結(jié)合而被磷酸化，從而強有力地激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(AKT/PI3K)通路，促使腫瘤細胞的分裂加快、遷徙能力增強及血管生成[15]。 HER-2、HER-3同為HER家族成員，有報道發(fā)現(xiàn)其協(xié)同表達率達49%[16]，但在本研究中，并未見兩者間表達存在相關(guān)性，可能與本研究的樣本量小有關(guān)。

綜上所述，HER-2在結(jié)直腸癌中的表達率很低，而HER-3在結(jié)直腸癌中的表達率高，且與臨床病理間關(guān)系密切。相對于HER-2，HER-3對結(jié)直腸癌惡性生物學(xué)行為的評估及預(yù)后判斷具有更加重要的指導(dǎo)意義。HER-3有可能成為結(jié)直腸癌靶向治療中改善患者預(yù)后的重要靶點。

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*基金項目：江西省贛州市指導(dǎo)性科技計劃課題，項目編號：GZ2014ZSF155

Expressions and clinical significance of HER-2 and HER-3 in colorectal cancer

Liu Chuanyuan,Xia Laiyang,Zhang Lei,et al.(General Surgery of Ganzhou People's Hospital,Jiangxi Province, China, 341600)

[Abstract]Objective To evaluate the HER-2 and HER-3 expressions and its correlation with clinical pathological parameters, and relationship between HER-2 and HER-3 in colorectal cancer patients. Methods The expressions of HER-2 and HER-3 proteins in 100 cases of colorectal carcinoma and 20 cases of normal colorectal tissues were detected using immunohistochemistry method，and the association between the expression and the clinicopathological parameter of colorectal carcinoma was analyzed. Results The positive results of HER-2 in colorectal carcinoma and normal tissues were 4% and 0% of the total, respectively (P>0.05). The positive results of HER-3 in colorectal carcinoma and normal tissues were 42% and 0%, respectively (P<0.05). High expression of HER-3 was associated with preoperative serum carcinoembryonic antigen (CEA) level and lymphovascular tumor thrombus (P<0.05). The expression of HER-2 in colorectal carcinoma was low, and the relationship between the expression and the clinicopathological parameter was not seen. In addition, there was no significant association between the HER-2 and HER-3 expressions. Conclusion The overexpression of HER-2 was detected in a small proportion of colorectal cancer patients. Considering the low rate of HER-2 overexpression in colorectal cancer, HER-2 probably plays an unimportant role in the development of colorectal cancer. The expression of HER-3 was correlated with preoperative serum CEA level and lymphovascular tumor thrombus, and associated with development and progression of colorectal cancer. HER-3 may be an important target of therapy in patients with colorectal cancer.

[Key words]Colorectal carcinoma; HER-2;HER-3;Immunohistochemistry

[收稿日期：2015-06-03]

[中圖分類號]R753.3

[文獻標志碼]A

[文章編號]1009-8771(2015)03-0182-05

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