邊會(huì)喜，蔡 靜，吳澤宇，張 弦，劉 健

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009）

高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法測(cè)定高脂飲食小鼠血清中槲皮素含量

邊會(huì)喜1，蔡 靜1，吳澤宇2，張 弦1，劉 健1

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009）

目的：建立用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器檢測(cè)法測(cè)定飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠血清中槲皮素含量的方法。方法：色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%甲酸溶液（40∶60，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.50 mL/min。結(jié)果：槲皮素在2.5～40 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 1），平均回收率為96.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.98%（n=5）。結(jié)論：該方法具有良好的回收率和重復(fù)性。可以對(duì)血清中的槲皮素實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。

高效液相色譜法；紫外檢測(cè)器；高脂飲食；血清；槲皮素

槲皮素是一種典型的黃酮類物質(zhì)，并且廣泛分布在植物中，大多以甙的形式存在，經(jīng)水解后可得槲皮素[1-2]。目前已經(jīng)證實(shí)槲皮素具有多種對(duì)人體健康有益的生物功能，包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗血小板凝集等活性[3-7]。有體外實(shí)驗(yàn)證明槲皮素能夠有效地改善肥胖和相關(guān)的胰島素抵抗[8-10]，另有研究證實(shí)槲皮素可以改善飲食誘導(dǎo)的肥胖模型、基因缺陷肥胖模型、化學(xué)誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物模型中胰島素敏感性[11-13]。因此，在研究槲皮素對(duì)飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠作用機(jī)制的過程中，為了對(duì)槲皮素進(jìn)行質(zhì)量濃度控制和穩(wěn)定性研究，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜紫外檢測(cè)器法對(duì)高脂飲食添加槲皮素喂養(yǎng)的小鼠血清中槲皮素的質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品號(hào)：Sigma-Q4951，≥95%，HPLC）、β-葡萄糖醛酸酶（標(biāo)準(zhǔn)品號(hào)：Type HP-2）；乙酸乙酯、甲醇、乙腈為色譜純、甲酸為分析純，水為高純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 Infinity高效液相色譜儀（配有紫外檢測(cè)器、ChemStation工作站）、Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱 美國(guó)安捷倫公司；QT-1型旋渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司；PURELAB Classic純水儀 英國(guó)Elga公司；CT14RD高速冷凍離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；MTN-2800D氮吹濃縮裝置 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；DHG-9101-2SA型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；FA1204B型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司。

1.3 動(dòng)物培養(yǎng)及樣品采集

將5 周齡的C57BL/6小鼠分為兩組，每組8 只，分別喂養(yǎng)高脂飲食和添加0.1%槲皮素的高脂飲食，喂養(yǎng)12周。飲食配方如表1所示，其中高脂飲食基于“Research Diets D12451”，包含4.73 kcal/g和45%脂肪能量。在此基礎(chǔ)上配制高脂飲食添加0.1%槲皮素的飼料。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲食配方表Table1 The composition of experimental diet

所有的小鼠都在SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，溫度維持在25 ℃，并且循環(huán)維持12 h的光照和12 h的黑暗環(huán)境。小鼠可以自由的攝取水和食物。12 周以后小鼠禁食過夜，然用CO2窒息處死。血液從心臟中取出，4 ℃靜置過夜，然后在5 000×g離心15 min收集血清，于－80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%甲酸溶液（40∶60，V/V）；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4.2 對(duì)照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取槲皮素對(duì)照品10.0 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇使其溶解并定容至刻度，搖勻，得200 μg/mL槲皮素對(duì)照品溶液。使用時(shí)根據(jù)需要稀釋至質(zhì)量濃度2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL。

1.4.3 樣品溶液的配制

將血清從－80 ℃取出，在室溫條件下融解，每個(gè)樣品取樣100 μL，加入10 μL抗壞血酸（0.1 mol/L）、100 μL高純水及250 μL醋酸鈉緩沖液（100 mmol/L，pH 5.0），簡(jiǎn)單混合后加入β-葡萄糖醛酸酶（HP-2型）（10 000 U），使用旋渦混合器混勻，置于37 ℃水浴中培養(yǎng)6 h。再使用2 mL的乙酸乙酯反復(fù)萃取3次。取乙酸乙酯部分并吹干，再用80 μL的95%的甲醇溶解，旋渦振蕩。5 000 r/min離心6 min后待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

槲皮素在360 nm波長(zhǎng)條件下色譜峰的峰形和檢測(cè)靈敏度符合檢測(cè)要求，結(jié)合參考文獻(xiàn)[14-15]，最終確定360 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 流動(dòng)相的選擇

分別采用不同比例的甲醇-乙腈-磷酸、甲醇-乙腈-水-磷酸、乙腈-磷酸、乙腈-甲酸溶液為流動(dòng)相[16-19]，對(duì)樣品的分離情況進(jìn)行考察，當(dāng)乙腈-0.2%甲酸（40∶60，V/V）時(shí)，槲皮素峰形較好。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖1所示。

圖1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 HPLC-UV chromatogram of quercetin standard solution

2.3 線性關(guān)系和精密度實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取5 組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，從低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度進(jìn)樣，每組重復(fù)3 次，按色譜條件測(cè)定其峰面積，以對(duì)照品在混合標(biāo)液中的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，得到的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測(cè)限（RSN=3）、定量限（RSN=10）見表2。從標(biāo)準(zhǔn)溶液中取槲皮素質(zhì)量濃度為10 μg/mL的一組溶液進(jìn)行了3 次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果表明槲皮素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.96%。

表2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測(cè)限、定量限Table2 Linear equation with correlation coeffi cients and linear ranges, and limits of detection and quantitation

2.4 穩(wěn)定性

取20 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，在6 h內(nèi)每2 h進(jìn)樣1 次，進(jìn)樣量20 μL，測(cè)定槲皮素的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.93%。結(jié)果表明：供試品溶液在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5 加標(biāo)回收率

取采用高脂飲食未添加槲皮素喂養(yǎng)的小鼠血清，分別添加不同量的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4.3節(jié)方法制備加標(biāo)樣品溶液，按規(guī)定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表3。槲皮素平均回收率為96.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.98%（n=5）。

表3 方法回收率和精密度（n=5）Table3 Recovery and precision of the method (n = 5)

2.6 樣品含量測(cè)定結(jié)果

表4 高脂飲食添加槲皮素喂養(yǎng)的小鼠血清中槲皮素的測(cè)定結(jié)果（n=7）Table4 Contents of quercetin in serum of high fat diet (HFD)-fed mice ((n = 7))

圖2 小鼠血清色譜圖Fig.2 HPLC-UV chromatograms of mouse sera

將7 只高脂飲食添加槲皮素喂養(yǎng)的小鼠血清樣本制備好，手動(dòng)進(jìn)樣，并按色譜條件平行進(jìn)行3 次測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算樣品中槲皮素的含量。測(cè)定結(jié)果見表4，樣品色譜圖見圖2。測(cè)定結(jié)果表明該方法具有良好的回收率和重復(fù)性，可以對(duì)血清中的槲皮素實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)將高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的小鼠飼料中添加槲皮素進(jìn)行喂養(yǎng)，采集血清，對(duì)其中的槲皮素含量進(jìn)行檢測(cè)。在制備樣品的過程中，為了防止槲皮素的氧化，加入抗壞血酸，并迅速檢測(cè)[20-21]。槲皮素作為一種醇溶性物質(zhì)，由于其結(jié)構(gòu)上具有酚羥基，可能會(huì)導(dǎo)致酚羥基電離成苷元陰離子造成峰拖尾現(xiàn)象，因此流動(dòng)相應(yīng)偏酸性，以抑制離解，使色譜峰的峰形得到改善，因此流動(dòng)相中加入甲酸[22-23]。有研究報(bào)道，大鼠灌胃槲皮素后的血漿中檢測(cè)不到槲皮素原形藥，而經(jīng)過徹底的酸水解后可檢測(cè)到槲皮素、異鼠李素等[24]。Graf等[25]發(fā)現(xiàn)，槲皮素經(jīng)過大鼠體內(nèi)代謝，血漿中產(chǎn)生大量的硫酸化的甲基槲皮素葡萄糖苷酸，說明血漿中的槲皮素以結(jié)合物的形式存在。因此采用β-葡萄糖醛酸酶水解后進(jìn)行檢測(cè)。而最終檢測(cè)樣品中目標(biāo)峰的拖尾現(xiàn)象應(yīng)該與槲皮素代謝物的水解有關(guān)，可用質(zhì)譜做進(jìn)一步的確認(rèn)。

本實(shí)驗(yàn)建立了用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器檢測(cè)法測(cè)定添加槲皮素的高脂飲食小鼠的血清中槲皮素的方法，并對(duì)其血清中所含的槲皮素含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，與相關(guān)報(bào)道的槲皮素質(zhì)量濃度在同一數(shù)量級(jí)內(nèi)[6-7]。本實(shí)驗(yàn)考察了色譜檢測(cè)條件，同時(shí)對(duì)方法的精密度、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率等進(jìn)行了考察，結(jié)果表明該方法相對(duì)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便易行。

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Determination of Quercetin in Serum of High Fat Diet-Fed Mice by HPLC-UV

BIAN Huixi1, CAI Jing1, WU Zeyu2, ZHANG Xian1, LIU Jian1
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Engineering Research Center of Bio-process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The quercetin content of serum from diet-induced obese mice was determined by high-performance liquid chromatography fi tted with an ultraviolet detector (HPLC-UV) and an Agilent Eclipse XDB-C18column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm). The mobile phase was a mixture of acetonitrile-0.2% formic acid (40:60, V/V) with a fl ow rate of 0.5 mL/min, and the detection wavelength was 360 nm. There was a good linear relationship for quercetin in the range of 2.5-40 μg/mL (r = 0.999 1). The average recovery rate for quercetin was 96.0% with relative standard deviation (RSD) of 10.98% (n = 5). This method could be used to determine quercetin in serum with good recovery rate and repeatability. It was a simple, rapid and accurate analytical method.

high performance liquid chromatography; ultraviolet detector; high fat diet; serum; quercetin

O657

A

1002-6630（2015）20-0086-04

10.7506/spkx1002-6630-201520015

2015-01-13

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171315）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2013HGQC0040）

邊會(huì)喜（1983—），男，博士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：bhx1983@163.com