李環(huán)宇 王 敏 李五霞 王曉琴 杜麗娟 冀曉龍（.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 700；.上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海 000）

木棗（Zizyphus jujubacv.Muzao）為鼠李科植物棗的果實，盛產于山西省呂梁地區(qū)和陜西省榆林地區(qū)，作為中草藥被廣泛使用。棗中富含糖類、皂苷、生物堿等多種生物活性物質［1］。研究證實，棗多糖具有抗腫瘤［2］、抗氧化［3］、調節(jié)機體免疫力［4］等功效。

近年來，人們圍繞木棗多糖的抗小鼠運動疲勞活性［5，6］展開了深入細致的研究，而木棗多糖的提取是對其功能進行研究的基礎，目前專門針對木棗多糖提取工藝優(yōu)化的報道還比較少。酶法和水提法是木棗多糖提取的常規(guī)方法［5－7］，然而它們均存在耗能大、時間長、效率低等缺點，亟需得到改進優(yōu)化。楊春等［8］采用超聲波輔助傳統(tǒng)水浸提法提取木棗多糖，但該研究料液pH取值范圍局限于偏中性和堿性，沒有考慮酸性條件對多糖提取效果的影響。樊君等［9］研究發(fā)現(xiàn)以緩沖液作為提取劑較傳統(tǒng)水提法在動力學上占優(yōu)勢，提取率也較高。所以本試驗擬采用檸檬酸鹽緩沖液作為提取溶劑，利用單因素試驗和響應面法優(yōu)化木棗多糖的超聲波輔助提取工藝，旨在為木棗多糖的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木棗：陜西省榆林市佳縣；

檸檬酸、檸檬酸鈉：分析純，天津市博迪化工有限公司；

重蒸酚：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

濃硫酸：分析純，四川西隴化工有限公司；

乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

數控超聲波清洗器：KQ－700DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

紫外—可見分光光度計：721型，上海光譜儀器有限公司；

旋轉蒸發(fā)器：SHZ－Ⅲ型，上海亞榮生化儀器廠；

低速離心機：KDC－40型，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；

精密pH計：HS－3C型，上海大普儀器有限公司；

真空冷凍干燥機：ZL－1型，上海醫(yī)療器械高等?？茖W校試驗廠。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助檸檬酸鹽緩沖溶液浸提木棗多糖工藝

棗粉→加入檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液→超聲波輔助提取→離心→濃縮→脫蛋白→透析→濃縮→無水乙醇沉淀→凍干→木棗多糖

1.3.2 操作要點

（1）樣品預處理：選擇全熟期的木棗鮮果，剔除殘次果，清洗、瀝干后人工去核、60℃干燥處理，粉碎后過60目篩，再經80%乙醇回流脫脂后風干，得到的棗粉密封保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）緩沖溶液的配制：分別配制0.1mol/L的檸檬酸及檸檬酸鈉溶液，并按比例配成不同pH的緩沖液。

（3）離心：轉速為3 500r/min，時間10min。

（4）濃縮：采用旋轉蒸發(fā)儀，溫度45℃，將提取液處理至原體積的1/3。

（5）脫蛋白：采用傳統(tǒng)Sevag法脫蛋白，Sevag試劑（氯仿︰正丁醇＝4︰1）與提取液體積比為3︰1，重復操作5次。

（6）透析：采用透析袋（Mw＜3 500Da），流水透析48h。

（7）凍干：首先將樣液置于－60℃冰箱中預凍6h，然后置于冷凍干燥機處理24h。

1.3.3 多糖含量測定 采用苯酚—硫酸法［10］。

1.3.4 多糖提取率計算 為了便于操作，將提取液離心處理，直接測定上清液中的多糖含量。將其與棗粉質量的比值定義為多糖提取率，并由此作為多糖提取效果的衡量標準［11］，多糖提取率按式（1）計算：

式中：

W——木棗多糖提取率，%；

ρ——葡萄糖質量濃度，mg/mL；

V——緩沖溶液的體積，mL；

n——測定時多糖液的稀釋倍數；m——脫脂后棗粉的質量，g。

1.3.5 單因素試驗設計 稱取2.0g棗粉置于小燒杯中，在其他條件相同的情況下，分別以檸檬酸鹽溶液pH、提取溫度、提取時間、超聲波功率、液料比為單因素進行超聲輔助緩沖液浸提木棗多糖試驗，以木棗多糖提取率為響應值，逐個考察不同條件對提取效果的影響。

（1）檸檬酸鹽溶液pH值的選擇：設定超聲波功率420 W，提取時間50min，提取溫度50℃，液料比25︰1（V︰m），比較pH 分別為3.2，4.0，4.8，5.6，6.4時的多糖提取率。

（2）提取溫度的選擇：設定超聲波功率420W，提取時間50min，pH 5.6，液料比25︰1（V︰m），比較提取溫度分別為40，50，60，70，80℃時的多糖提取率。

（3）提取時間的選擇：設定超聲波功率420W，pH 5.6，提取溫度50℃，液料比25︰1（V︰m），比較提取時間分別為10，30，50，70，90min時的多糖提取率。

（4）超聲波功率的選擇：設定提取溫度50℃，提取時間50min，pH 5.6，液料比25︰1（V︰m），比較超聲波功率分別為280，350，420，490，560W 時的多糖提取率。

（5）液料比的選擇：設定超聲波功率420W，提取時間50min，提取溫度50℃，pH 5.6，比較液料比分別為10︰1，20︰1，30︰1，40︰1，50︰1（V︰m）時的多糖提取率。1.3.6 響應面試驗設計 根據單因素試驗結果，篩選對提取率影響顯著的單因素為變量，以多糖提取率為響應值，采用Box－Behnken試驗設計方法對檸檬酸—檸檬酸鹽緩沖液作為溶劑，超聲波輔助提取木棗多糖工藝進行優(yōu)化。

1.3.7 熱水浸提木棗多糖 以蒸餾水為提取劑，在液料比23.1︰1（V︰m），浸提溫度90℃，浸提時間180min條件下提取木棗多糖。其余操作均與超聲波輔助檸檬酸鹽緩沖溶液浸提木棗多糖一致。

1.3.8 數據分析 采用Excel 2007和SPSS19對單因素試驗中的各因素進行比較分析。采用Design－Expert 8.05b進行響應面試驗設計和分析。所有試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 檸檬酸鹽溶液pH對多糖提取率的影響 由圖1可知，隨著pH值的升高，木棗多糖提取率呈先降低再升高而后又降低的趨勢；在pH 4出現(xiàn)最小值，在pH 5.6時有明顯最大值。這可能與某些特定基團在特定pH條件下溶解性不同有關［12］；超聲波作用使某些酶被激活，這些酶參與的細胞生理化學過程，在pH 5.6時協(xié)同作用最強。由于pH對多糖提取率影響不顯著，所以緩沖溶液的pH不作為響應面試驗設計的因素，選擇固定pH為5.6進行后續(xù)試驗。

圖1 pH對多糖提取率的影響Figure 1 Effect of pH on extraction rate of polysaccharides

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響Figure 2 Effect of treatment temperature on extraction rate of polysaccharide

2.1.2 提取溫度對多糖提取率的影響 由圖2可知，在40～70℃范圍內，隨著溫度的升高，多糖的提取率升高，這可能是因為超聲波引起的空化作用產生的極大壓力造成生物細胞壁破裂，多糖的溶解度升高；超聲波作用激活的某些酶，促使細胞的新陳代謝過程加速，提取率升高［13］；在70℃達到峰值，繼續(xù)升高溫度，多糖提取率出現(xiàn)下降的情況，可能是溫度過高對多糖的結構產生影響；也可能是溫度過高使得某些酶活性降低，這些酶參與的生理化學反應減弱，細胞新陳代謝過程減慢導致［14］。因此提取溫度應控制在60～80℃。

2.1.3 提取時間對多糖提取率的影響 由圖3可知，提取時間越長，提取率越高。提取時間在30min以內，提取率增高明顯，但是由30min延長至90min多糖的提取率增加緩慢。這可能是由于短時間的超聲處理，介質內部的空化作用增強，溶劑中瞬間產生的空化氣泡迅速崩潰，溫度瞬間升高，棗粉迅速被擊碎［15］，多糖提取率快速升高。但是超聲波處理時間過長就會產生劇烈的機械剪切作用和引起過多的熱量聚集，使多糖發(fā)生降解，多糖提取率隨之增長緩慢［16］。所以從提高生產效率和節(jié)約成本的角度，選擇提取時間30min為宜。

2.1.4 超聲波功率對多糖提取率的影響 由圖4可知，隨著超聲波功率的增大，多糖提取率先升高而后逐漸降低，420 W時出現(xiàn)峰值。原因可能是：超聲波功率太低時，細胞壁的破碎程度低，多糖溶出慢；隨著功率的提高，產生的熱作用愈強，對液體顆粒的機械作用越明顯，多糖溶出速率變快［17］；但是超聲波功率太大時，一些能使目標物降解的酶被充分釋放出來，造成多糖提取率降低［18］。綜合考慮，選擇超聲波功率350～490W。

圖3 提取時間對多糖提取率的影響Figure 3 Effect of treatment time on extraction rate of polysaccharides

圖4 超聲波功率對多糖提取率的影響Figure 4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysaccharides

2.1.5 液料比對多糖提取率的影響 由圖5可知，液料比對多糖提取率有顯著影響，隨著液料比增大，木棗多糖提取率先逐漸增高而后逐漸降低，在20︰1（V︰m）時出現(xiàn)峰值。其原因可能是液料比為20︰1（V︰m）時，超聲波在液體中形成最大比例的有效的攪動和流動，達到最高的提取率。隨著液料比增大，樣品溶液的濃度降低，超聲波對懸浮于液體中的微粒的凝聚作用相對減弱，使得提取率降低［14］?？紤]到后續(xù)處理工藝，液料比取10︰1～30︰1（V︰m）為宜。

圖5 液料比對多糖提取率的影響Figure 5 Effect of liquid－solid ratio on extraction rate of polysaccharides

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面分析因素水平的選擇 根據Box－Behnken試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，確定在pH 5.6、提取時間30min條件下，以提取溫度、液料比、超聲波功率為自變量，多糖提取率為響應值，設計三因素三水平試驗，試驗因素與水平見表1，試驗設計及結果見表2。

2.2.2 響應面優(yōu)化試驗結果分析 根據表2結果，利用Design Expert 8.05b軟件對所得數據進行多元回歸擬合，得到木棗多糖提取率對提取溫度、液料比和超聲功率的二次多項回歸方程為：

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

表2 Box－Behnken試驗設計及結果Table 2 Experimental design and result for response surface analysis

該回歸模型的方差分析結果見表3。由表3可知，回歸模型（P＜0.01）達到極顯著水平；失擬項（P＝0.550 1＞0.1）影響不顯著，且相關系數R2＝0.996 2，表明實測值與預測值高度相關。綜上所述，建立的回歸模型擬合度高，可用該模型較好地描述各因素與響應值之間的實際關系，可用該模型預測木棗多糖的提取工藝條件。從該回歸模型的方差分析還可以看出，3個因素對木棗多糖提取率的影響均不是簡單的線性關系。除了液料比和超聲功率的交互作用不顯著，其他一次項、交互項和二次項對木棗多糖提取率的影響均達到顯著水平。各因素對多糖提取率的影響程度大小順序為：液料比＞超聲波功率＞提取溫度。

根 據表2試驗所得的響應面圖見圖6～8。由圖6～8可知，液料比對木棗多糖提取率的影響極為顯著，其繪制的曲線最為陡峭；超聲波功率對木棗多糖的影響次之，而影響最小的則是提取溫度，與提取溫度相比，其曲線較為平滑一些。此外，圖6（b）和圖7（b）中的等高線呈明顯的橢圓形，說明提取溫度和液料比，提取溫度和超聲功率之間均具有非常顯著的交互作用。這些結果與表3的結果相一致。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

＊顯著（P＜0.05）；＊＊極顯著（P＜0.01）。

方差來源 自由度 平方和 均方 F值 P 值 顯著性X1 1 8.76 8.77 8.79 0.031 3＊X2 1 295.85 296.08 296.61 ＜0.000 1 ＊＊X3 1 9.50 9.51 9.52 0.027 2 ＊X1X2 1 197.26 197.30 197.65 ＜0.000 1 ＊＊X1X3 1 21.07 21.00 21.04 0.005 8 ＊＊X2X3 1 6.50 6.49 6.51 0.050 9 X12 1 335.72 335.78 336.38 ＜0.000 1 ＊＊X22 1 475.69 475.47 476.32 ＜0.000 1 ＊＊X32 1 22.22 22.16 22.20 0.005 2 ＊＊模型 9 1 296.79 144.09 144.35 ＜0.000 1 ＊＊誤差項 5 4.98 1.00失擬項 3 2.92 0.98 0.95 0.550 1純誤差 2 2.06 1.03所有項14 1 301.76

圖6 提取溫度和液料比交互作用對木棗多糖的提取率影響的響應面圖Figure 6 Response surface plots for the interaction effects between extraction temperature and liquid－solid ratio on the polysaccharides extraction ratio of Zizyphus jujube cv.Muzao

圖7 提取溫度和超聲功率交互作用對木棗多糖的提取率影響的響應面圖Figure 7 Response surface plots for the interaction effects between extraction temperature and ultrasonic power on the polysaccharides extraction ratio of Zizyphus jujube cv.Muzao

圖8 液料比和超聲功率交互作用對木棗多糖的提取率影響的響應面圖Figure 8 Response surface plots for the interaction effects between liquid－solid ratio and ultrasonic power on the polysaccharides extraction ratio of Zizyphus jujube cv.Muzao

2.2.3 模型驗證 通過Design－Expert 8.05b軟件進行數據分析確定各因素的最佳取值，Y的最大估計值67.63%，穩(wěn)定點（X1，X2，X3）的編碼值為（－0.16，0.31，－0.06）。與之對應的提取溫度68.4℃、液料比23.1︰1（V︰m）、超聲波功率415.8W。考慮實際操作的便利，將提取工藝參數修正為超聲波功率420W，提取溫度68℃，液料比23.1︰1（V︰m），pH 5.6，時間30min，并進行3次平行驗證實驗，實際測得的多糖提取率為（67.38±0.16）%，實測值與預測值相對誤差＜1%，說明回歸方程擬合度高。

2.3 不同提取方法的比較

由表4可知，與熱水浸提法相比，超聲波輔助檸檬酸鹽緩沖溶液浸提木棗多糖可使多糖提取率提高66.41%，效果十分顯著。

3 結論

本試驗在單因素的基礎上，利用Box－Behnken響應面法對木棗多糖的超聲波輔助酸性緩沖液浸提工藝進行優(yōu)化研究。結果表明，其提取工藝條件為：以pH為5.6的檸檬酸鹽緩沖溶液為提取劑，液料比23.1︰1（V︰m），超聲波功率420W，提取溫度68℃，時間30min。該條件下木棗多糖的實測提取率為（67.38±0.16）%。與傳統(tǒng)熱水提取法相比，超聲波輔助酸性緩沖溶液浸提木棗多糖能顯著縮短提取時間，降低提取溫度，提高多糖提取率，可為木棗的開發(fā)利用和木棗多糖的研究提供依據，但是關于此方法提取的木棗多糖的生物活性還有待于進一步的研究。

表4 不同提取方法的比較Table 4 Comparison of different extraction methods

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