王亞琦 陳奕洪 黃衛(wèi)文，3 莫啟武 周 潔（.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 000；.廣東江門市藏壽天然藝術(shù)品有限公司，廣東 江門 59000；3.稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 000；.國家輕工業(yè)香料化妝品洗滌用品質(zhì)量監(jiān)督檢測廣州站，廣東 廣州 50075）

崖柏（Thuja sutchuenensis）為柏科（cupressaceae）崖柏屬（thuja）常綠喬木，是一類起源于恐龍時(shí)代的“活化石”［1］。經(jīng)研究［2－4］發(fā)現(xiàn)，崖柏的根、莖、葉中含有羅漢柏烯、α－蒎烯、檸檬烯等萜類化合物，這些萜類化合物脂溶性佳，分子小，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降血壓、驅(qū)蟲、抗炎、利尿、祛痰、健身強(qiáng)體的功效。從崖柏中提取的崖柏精油亦含有上述許多有益成分，可應(yīng)用于醫(yī)療保健、食品工業(yè)、果蔬保鮮、日用化妝品等領(lǐng)域［5］。超臨界CO2流體萃取方法應(yīng)用于植物精油的提取，具有萃取速度快、效率高，產(chǎn)品分離流程簡單且應(yīng)用廣等優(yōu)點(diǎn)［6，7］。由于崖柏資源的稀有，尚未見用超臨界CO2萃取崖柏精油的報(bào)道，近年來，已進(jìn)行了崖柏的人工種植試驗(yàn)，并獲得成功，為對崖柏的研究開發(fā)提供了條件［8，9］。本研究擬采用超臨界CO2流體萃取法從崖柏中提取精油，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳的萃取工藝條件，并采用GC—MC對該工藝獲得的崖柏精油進(jìn)行成分分析和鑒定，為崖柏?cái)U(kuò)大種植及其開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

崖柏（根部）切片：5mm×5mm×0.2mm，廣東江門市藏壽天然藝術(shù)品有限公司；

二氧化碳：純度≥99.9%，長沙中益氣體有限公司；

二氯甲烷：色譜純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超臨界CO2萃取裝置：DY120－50－02型，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；

氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀：QP2010Ultra型，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

崖柏根切片→超臨界CO2萃取（CO2鋼瓶→冷卻系統(tǒng)→高壓泵→萃取釜→分離釜）→收集精油

1.3.2 工藝方法 準(zhǔn)確稱取150.0g崖柏切片裝入2L的超臨界CO2萃取釜中，啟動(dòng)設(shè)備，調(diào)節(jié)萃取釜和分離釜的溫度、壓力及CO2流量進(jìn)行循環(huán)萃取，萃取一定時(shí)間后從分離釜中收集萃出物，準(zhǔn)確測定所得精油的體積和質(zhì)量，置于4℃密封保存并計(jì)算崖柏精油的提取率。

1.3.3 崖柏精油得率 按式（1）計(jì)算：

1.3.4 裝料系數(shù)計(jì)算 本試驗(yàn)所用小試裝置萃取釜容積為2L，測定出2L的萃取釜中裝滿崖柏切片的總重量為220g。裝料系數(shù)按式（2）計(jì)算：

1.3.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）物料裝料系數(shù)：稱取150.0g崖柏切片，固定萃取壓力20MPa、萃取溫度45℃、分離壓力8MPa、分離溫度50℃、CO2流速1.5L/min、靜態(tài)萃取時(shí)間30min、動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間50min條件下，研究物料裝料系數(shù)（0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9）對崖柏精油提取率的影響。

（2）萃取壓力：稱取150.0g崖柏切片，固定萃取溫度45℃、分離壓力8MPa、分離溫度50℃、CO2流速1.5L/min、靜態(tài)萃取時(shí)間30min、動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間50min條件下，研究萃取壓力（10，15，20，25，30，35MPa）對崖柏精油提取率的影響。

（3）萃取溫度：稱取150.0g崖柏切片，固定萃取壓力20 MPa、分 離 壓 力 8MPa、分 離 溫 度50 ℃、CO2流 速1.5L/min、靜態(tài)萃取時(shí)間30min、動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間為50min條件下，研究萃取溫度（35，40，45，50，55，60 ℃）對崖柏精油提取率的影響。

（4）靜態(tài)萃取時(shí)間：稱取150.0g崖柏切片，固定萃取壓力20MPa、萃取溫度45℃、分離壓力8MPa、分離溫度50℃、CO2流速1.5L/min、動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間50min條件下，研究靜態(tài)萃取時(shí)間（10，20，30，40，50min）對崖柏精油提取率的影響。

（5）動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間：稱取150.0g崖柏切片，固定萃取壓力20MPa、萃取溫度45℃、分離壓力8MPa、分離溫度50℃、CO2流速1.5L/min、靜態(tài)萃取時(shí)間30min條件下，研究動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間（10，30，50，70，90min）對崖柏精油提取率的影響。

1.3.6 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取萃取壓力、萃取溫度以及動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間進(jìn)行3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)，優(yōu)化崖柏精油的萃取工藝條件。

1.3.7 精油分析方法 所得到最佳工藝的崖柏精油用二氯甲烷稀釋10倍，過0.22μm有機(jī)濾膜后進(jìn)行GC—MC鑒定分析。

（1）氣相色譜條件：Rtx－5MS（30m×0.25mm×0.25μm）色譜柱，進(jìn)樣量1μL，分流比100︰1，進(jìn)樣口溫度260℃，流速1mL/min，載氣為高純氦氣。程序升溫：初始溫度90℃（保持5min），以3℃/min速度升至220℃（保持5min），再以10℃/min升至250℃。

（2）質(zhì)譜條件：EI電離源，電離電壓70eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，傳輸線溫度250℃，標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧，SCAN質(zhì)量掃描，溶劑延遲5min，掃描范圍35～600amu。

（3）成分解析：GC—MS分析，獲得精油的總離子流色譜圖（TIC），利用NIST05質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索標(biāo)準(zhǔn)譜庫解析成分，對所得的譜圖進(jìn)行檢索，相似度大于85%作為結(jié)構(gòu)確認(rèn)依據(jù)，以峰面積歸一法計(jì)算各組分相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 物料裝料系數(shù)對崖柏精油萃取率的影響 超臨界CO2流體萃取的過程中，在不同的溫度和壓力下，萃取物料可能會發(fā)生不同程度膨脹等現(xiàn)象，如果物料裝量過滿，容易造成堵塞，物料裝量過少會直接影響萃取的收率。由圖1可知，裝料系數(shù)過小，提取率較低，主要因?yàn)檩腿∥锪线^少，剩余空間大與CO2流體偏流，且萃取總量過小，管道損失較大。隨著裝料系數(shù)的增大提取率也增大，在0.6～0.8時(shí)有較大的提取率，最后考慮提取率和安全性，選擇裝料系數(shù)為0.68（150g）做后續(xù)的試驗(yàn)。

圖1 崖柏切片裝料系數(shù)對崖柏精油提取率的影響Figure 1 Effect of filling coefficient on Thuja sutchuenensis essential oil extraction rate

2.1.2 萃取壓力對崖柏精油提取率的影響 由圖2可知，隨著萃取壓力增大，萃取率也增加，主要因?yàn)閴毫υ龃螅R界流體密度隨之增大，從而萃取物在流體中的溶解度增大，當(dāng)萃取壓力達(dá)到20MPa時(shí)萃取量最大。隨后萃取壓力繼續(xù)增加，崖柏精油的萃取率逐漸降低，可能是因?yàn)檩腿毫υ龈吆?，CO2流體的密度必然變得更大，而CO2流體的擴(kuò)散性能會相應(yīng)地減弱，從而造成兩相接觸傳質(zhì)速率的降低。同時(shí)在實(shí)際生產(chǎn)過程中，萃取壓力太高會使成本變高，同樣存在安全隱患，所以初步選擇20MPa為宜。

圖2 萃取壓力對崖柏精油提取率的影響Figure 2 Effect of extraction pressure on Thuja sutchuenensis essential oil extraction rate

2.1.3 萃取溫度對崖柏精油提取率的影響 由圖3可知，崖柏精油提取率先隨溫度升高而增加，50℃達(dá)到最大，溫度繼續(xù)升高，崖柏精油萃取率反而降低。溫度升高，一方面溶質(zhì)萃取精油在CO2流體的熱運(yùn)動(dòng)速度加快，相應(yīng)的溶劑蒸氣壓增大，使得溶解度增大，另一方面，溫度繼續(xù)升高，CO2流體密度變小，萃取物在CO2流體中的溶解度也相應(yīng)減少，而且過高溫度也會導(dǎo)致膠體浸出影響細(xì)胞壁的通透性導(dǎo)致精油難以帶出，所以綜合考慮選擇50℃為宜。

圖3 萃取溫度對崖柏精油提取率的影響Figure 3 Effect of extraction temperature on Thuja sutchuenensis essential oil extraction rate

2.1.4 靜態(tài)萃取時(shí)間對提取率的影響 由圖4可知，隨著靜態(tài)萃取時(shí)間的變化，萃取率變化不明顯，可能是因?yàn)檠掳丶?xì)胞壁的通透性較好，在30min有最大的萃取率，最后靜態(tài)萃取時(shí)間選擇30min為宜。

2.1.5 動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間對崖柏精油提取率的影響 由圖5可知，崖柏精油萃取率隨動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間的延長而提高，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間在10～50min時(shí)，萃取率增加明顯，在50min時(shí)達(dá)最大值，之后提取率無明顯變化，從提取率和節(jié)能低耗方面考慮選擇50min為最佳動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間。

圖4 靜態(tài)萃取時(shí)間對崖柏精油提取率的影響Figure 4 Effect of static time on Thuja sutchuenensis essential oil extraction rate

圖5 動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間對崖柏精油提取率的影響Figure 5 Effect of dynamic time on Thuja sutchuenensis essential oil extraction rate

2.2 崖柏精油提取工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，萃取壓力、萃取溫度、動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間對崖柏精油的提取率有較大影響，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步考察各因素對精油提取率的影響，優(yōu)化提取工藝，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

由表2可知，各因素對提取率影響程度依次為：A＞B＞C，即：萃取壓力＞萃取溫度＞動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間。最佳提取條件為A2B2C3，即萃取壓力20MPa，萃取溫度50℃，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間60min。根據(jù)表3方差分析萃取壓力顯著，其他兩個(gè)因素不顯著。

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 崖柏精油的提取在最佳工藝條件下，重復(fù)5次進(jìn)行驗(yàn)證，提取率分別為7.23%，7.29%，7.31%，7.20%，7.25%，平均提取率為7.26%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.044 5，RSD為0.006 1，表明此試驗(yàn)有良好的重現(xiàn)性。

表2 L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of L9（33）orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

F0.01（1，2）＝99；F0.05（1，2）＝19。

方差來源 離差平方和 自由度 均方（MS） F值 Sig.A 1.160 2 0.583 43.341 0.023 B 0.286 2 0.143 10.675 0.086 C 0.213 2 0.107 7.974 0.111 D 0.002 7 2 0.013 1.000誤差E 0.03 2總和T 1.67 8

2.3 崖柏精油GC—MS分析

由表4可知，最佳工藝條件下用超臨界CO2萃取的崖柏精油經(jīng)GC—MS分析鑒定出的28種化學(xué)成分中，以萜烯類化合物為主，其中羅漢柏烯、α－雪松醇和花側(cè)柏烯的含量較高，其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為45.50%，25.72%，7.11%。

3 結(jié)論

采用超臨界CO2萃取可有效提取崖柏精油，提取率高于普通水蒸氣蒸餾法，且縮短了萃取時(shí)間，具有低耗、高效、無污染等優(yōu)點(diǎn)。本研究對超臨界CO2萃取崖柏精油中單因素條件（物料裝料系數(shù)、萃取壓力、萃取溫度、靜態(tài)萃取時(shí)間、動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間）進(jìn)行探究，并通過正交試驗(yàn)對萃取率有較大影響的3個(gè)因素（萃取壓力、萃取溫度、動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間）進(jìn)行工藝優(yōu)化，結(jié)果表明最佳提取工藝為：物料裝料系數(shù)0.68，萃取壓力20MPa，萃取溫度50℃，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間60min，靜態(tài)萃取時(shí)間30min，此工藝條件下崖柏精油提取率為7.20%～7.31%。

表4 崖柏精油GC—MS分析結(jié)果Table 4 Analytic results of GC—MS of Thujasutchuenensis essential oil

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