付 凌 宋劍波 胡春燕 曾黎明

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，南昌 330045)

?；撬崾菑V泛存在于人和動物體內(nèi)的一種游離的含硫活性物質(zhì)，其不僅能從食物中直接獲取，還能通過半胱氨酸氧化轉(zhuǎn)氨基作用內(nèi)源生成。大量研究已經(jīng)證實牛磺酸具有多種生理功能，如抗氧化作用、抗炎癥反應(yīng)、維持糖代謝以及血管舒張等［1-3］。不僅如此，由于?；撬嵩趧游餀C體內(nèi)可同時作為神經(jīng)遞質(zhì)，其在神經(jīng)退化性疾病上的作用已經(jīng)在動物營養(yǎng)和醫(yī)療等領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注。

肝臟是合成?；撬岬闹饕獔鏊?，大量臨床和基礎(chǔ)研究表明?；撬釋Ω闻K損傷有保護作用。如Wei等［4］研究報道，?；撬崮軌蛞种品至言せ畹牡鞍准っ?p38MAPK)的磷酸化以及核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)的活性，從而緩解牛磺膽酸誘導(dǎo)的大鼠肝臟損傷。不僅如此，體外試驗也證實了?；撬釋ρ趸瘧?yīng)激等誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞損傷也具有保護作用［5］。而目前關(guān)于?；撬犷A(yù)處理對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肝臟損傷的保護作用研究較少，因此，本試驗旨在探討添加2.5%的?；撬釋PS誘導(dǎo)的小鼠急性肝臟損傷的緩解效果，以期為肝臟損傷的預(yù)防和治療及?；撬嵩趧游餇I養(yǎng)上的運用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和試劑

30只癌癥研究小鼠(ICR小鼠)，雄性，體重(22±3)g，購于重慶市騰鑫生物技術(shù)有限公司。牛磺酸(T103829-100 g，純度 99%)和 LPS(L118716，純度99%)購于阿拉丁試劑有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

小鼠預(yù)飼3 d后，隨機分為3組，每組10只(n=10):對照組和LPS組飼喂基礎(chǔ)飼糧(基礎(chǔ)飼糧購于重慶市騰鑫生物技術(shù)有限公司)，?；撬峤M在基礎(chǔ)飼糧中添加2.5%的牛磺酸。?；撬岬奶砑恿繀⒄誐aia等［6］的研究結(jié)果設(shè)定。小鼠飼養(yǎng)在人工控制的環(huán)境中，12 h光照(07:00—19:00)和12 h黑暗，溫度(23±2)℃，濕度(50±10)%，自由采食和飲水。正式試驗開始1周后，LPS組和?；撬峤M小鼠腹腔注射10 mg/kg的LPS(LPS溶解于生理鹽水，注射劑量為0.2 mL/只)，對照組小鼠腹腔注射同體積的生理鹽水。LPS注射24 h后，小鼠屠宰取樣。

1.3 測定指標(biāo)和方法

1.3.1 平均日增重和肝臟指數(shù)

試驗期內(nèi)，每日稱量小鼠體重，計算平均日增重。LPS注射24 h后，所有小鼠頸椎脫臼死后無菌摘取肝臟，用濾紙吸去血液，用眼科剪剪去脂肪和系膜后稱重，計算肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)(g/kg)=肝臟重量(g)/體重(kg)。

1.3.2 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性的測定

小鼠處死前，于眼眶采血，3 500 r/min離心10 min，取上清用全自動生化分析儀測定血清中ALT和AST活性，測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3.3 肝臟氧化應(yīng)激參數(shù)的檢測

準(zhǔn)確稱取部分肝臟組織，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清用于檢測肝臟丙二醛(MDA)含量以及谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性，檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.3.4 肝臟組織形態(tài)檢測

取1 cm×1 cm×1 cm左右的肝臟組織樣品，保存于10%的福爾馬林溶液，然后制作石蠟切片，并進行蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.3.5 肝臟抗氧化基因及轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、Kelch樣ECH相關(guān)蛋白(Keap1)表達(dá)的測定

肝臟總RNA的提取參照Trizol說明書，然后取1μg總RNA立即采用TaKaRa Prime Script RT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)。實時熒光定量方法參照TaKaRa SYBR Premix Ex Taq定量試劑盒說明書。利用2-△△Ct對定量結(jié)果進行整理分析［5］，△△Ct=(Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因)試驗組-(Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。實時熒光定量 PCR 引物序列見表1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計整理，然后采用SPSS 19.0對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(oneway ANOVA)，然后用Duncan氏法進行多重比較，P＜0.05為差異顯著。數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?；撬釋PS處理小鼠平均日增重和肝臟指數(shù)的影響

由表2可知，LPS注射前，各組平均日增重?zé)o顯著差異(P＞0.05);注射 LPS后，LPS組平均日增重較對照組顯著下降(P＜0.05)，而?；撬峤M則與這2組均沒有顯著差異(P＞0.05)。此外，LPS組肝臟指數(shù)較對照組顯著上升(P＜0.05)，而?；撬峤M肝臟指數(shù)則與對照組差異不顯著(P＞0.05)，說明添加?；撬峋徑饬诵∈蟾闻K損傷。

2.2 ?；撬釋?LPS處理小鼠血清 ALT和 AST活性的影響

由表3可知，與對照組相比，LPS組血清ALT和AST活性分別增加了61%和30%(P＜0.05)，由此可見LPS造成了小鼠肝臟損傷。與對照組相比，?；撬峤M血清ALT和AST活性分別增加了40%(P＜0.05)和 18%(P＞0.05)，這說明，在本試驗中，添加2.5%的?；撬釋PS誘導(dǎo)的肝臟損傷起到了一定的緩解作用。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 The primer sequences for real-time qPCR

表2 小鼠平均日增重和肝臟指數(shù)Table 2 Average daily gain and liver index of mice(n=10)

表3 小鼠血清ALT和AST活性Table 3 Serum ALT and AST activities of mice(n=10) U/L

2.3 牛磺酸對LPS處理小鼠肝臟氧化應(yīng)激參數(shù)的影響

由表4可知，與對照組相比，腹腔注射LPS顯著增加了肝臟MDA含量并降低了GPx的活性(P＜0.05);添加?；撬釋PS引起的肝臟 MDA含量增加和GPx活性降低起到了一定的緩解作用，但是差異不顯著(P＞0.05)。各組肝臟SOD和CAT活性均沒有顯著變化(P＞0.05)。

表4 小鼠肝臟氧化應(yīng)激參數(shù)Table 4 Liver oxidative stress parameters of mice(n=10)

2.4 ?；撬釋PS處理小鼠肝臟形態(tài)的影響

由圖1可知，對照組小鼠肝臟組織細(xì)胞排列緊密有序，結(jié)構(gòu)完整，未出現(xiàn)任何損傷跡象;LPS組小鼠肝臟細(xì)胞排列紊亂疏松，且呈現(xiàn)出中性淋巴細(xì)胞侵潤;而?；撬峤M較LPS組肝臟損傷情況要輕。

圖1 肝臟形態(tài)學(xué)檢測Fig.1 Liver morphological detection(400×)

2.5 牛磺酸對LPS處理小鼠肝臟抗氧化基因及Nrf2和Keap1表達(dá)的影響

由圖2可知，與對照組相比，腹腔注射LPS顯著下調(diào)了肝臟GPx1、SOD1以及Nrf2的相對表達(dá)量(P＜0.05);盡管添加?；撬釋Ω闻K SOD1的相對表達(dá)量沒有產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)，但是顯著上調(diào)了肝臟GPx1和Nrf2的相對表達(dá)量(P＜0.05)，并且GPx1的相對表達(dá)量還達(dá)到與對照組差異不顯著(P＞0.05)。此外，?；撬岷蚅PS處理對肝臟GPx2、SOD2、CAT以及Keap1的相對表達(dá)量均沒有顯著影響(P＞0.05)。

3 討論

Li等［7］研究表明，腹腔注射 100 mg/kg的LPS顯著增加了斷奶仔豬肝細(xì)胞的核溶解、核固縮以及細(xì)胞增殖血液ALT和AST活性。Roller等［8］研究了LPS對小鼠肝臟的損傷作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)了肝細(xì)胞的凋亡反應(yīng)，且顯著增加了血液ALT和AST活性，其機制可能是由于LPS介導(dǎo)了環(huán)氧化酶的表達(dá)。在本試驗中，注射10 mg/kg LPS影響了小鼠的肝臟形態(tài)和肝臟指數(shù)，且顯著增加了血清ALT和AST活性，與上述前人報道一致。正常情況下，ALT和AST主要存在于肝臟細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝臟受到損傷時，ALT和AST被釋放進入血液，因此血液ALT和AST活性是主要的肝臟損傷指標(biāo)［9］。Maia等［6］研究報道，添加2.5%牛磺酸能夠顯著緩解小鼠氧化應(yīng)激損傷，且對生產(chǎn)性能具有一定的促進作用。因此，本試驗選用2.5%作為?；撬岬奶砑恿浚Y(jié)果發(fā)現(xiàn)?；撬犸@著降低了小鼠的肝臟指數(shù)，并對LPS誘導(dǎo)的血清ALT和AST活性升高起到了一定的緩解。此外，其他一些研究也表明?；撬釋λ穆然?CCl4)和冷缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠肝臟損傷均具有保護作用［10-11］。然而，Deminice 等［12］最近研究表明，添加牛磺酸并沒有對膽堿缺乏誘導(dǎo)的大鼠肝臟損傷起到緩解作用。這可能是由于?；撬釋Σ煌闻K損傷模型的敏感性存在差異等造成的。

圖2 小鼠肝臟抗氧化基因及Nrf2和Keap1的表達(dá)Fig.2 The expression of liver antioxidant genes，Nrf2 and Keap1 of mice(n=10)

許多研究已經(jīng)證實，肝臟損傷往往伴隨著氧化應(yīng)激，且氧化應(yīng)激對肝臟損傷或肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展具有促進作用［13-14］。Zhu 等［15］研究表明，在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟損傷模型中，肝臟脂質(zhì)氧化和MDA含量顯著增加;Kim等［16］也報道了大鼠在急性熱應(yīng)激后肝臟MDA含量顯著增加，微陣列分析發(fā)現(xiàn)與氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強。在本試驗中，注射LPS顯著增加了小鼠肝臟MDA含量，并抑制了肝臟GPx的活性。MDA是脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，目前已經(jīng)被廣泛當(dāng)作一種氧化應(yīng)激標(biāo)記物，而GPx是機體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。由此可見，本試驗中LPS誘導(dǎo)了小鼠肝臟氧化應(yīng)激。近年來，?；撬岬目寡趸饔靡呀?jīng)得到證實，因此?；撬嵋脖粡V泛用于氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的研究。Zhang等［17］建立了鐵誘導(dǎo)的氧化損傷，結(jié)果表明添加?；撬犸@著緩解了脂質(zhì)氧化，并提高了抗氧化物酶的活性，從而抑制了氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肝臟細(xì)胞凋亡。而在本試驗中，盡管添加?；撬釋PS誘導(dǎo)的肝臟MDA含量增加和GPx活性降低具有一定的緩解作用，但是差異不顯著。這與Jeon等［18］的研究結(jié)果存在一定的分歧，他們報道?；撬崮軌蝻@著抑制LPS誘導(dǎo)的氧自由基產(chǎn)生，從而緩解了氧化損傷。通過仔細(xì)比較發(fā)現(xiàn)，Jeon等［18］的試驗與本研究存在很大的差異，例如?；撬岷蚅PS作用劑量和檢測指標(biāo)等，這些差異可能最終導(dǎo)致了研究結(jié)果的不一致。

抗氧化基因的表達(dá)對抗氧化物酶的釋放起著直接調(diào)控作用，因此本試驗進一步檢測了肝臟抗氧化基因的表達(dá)。與肝臟抗氧化物酶活性一致，LPS抑制了肝臟 GPx1和SOD1的表達(dá)，但是對GPx2、SOD2以及CAT的表達(dá)沒有顯著影響。此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)添加?；撬犸@著緩解了LPS對GPx1表達(dá)的抑制作用。目前有關(guān)于牛磺酸對GPx1表達(dá)的上調(diào)作用鮮有報道，但是Chang等［19］研究也表明，在飲水中添加0.35%或0.70%的?；撬峥赏ㄟ^上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)和偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的表達(dá)介導(dǎo)SOD和CAT活性，從而緩解高脂飼糧誘導(dǎo)的小鼠肝脂肪變性和氧化應(yīng)激。此外，Chen等［20］也報道了?；撬崮軌蚓徑饩凭T導(dǎo)的肝臟炎癥基因上調(diào)，從而緩解氧化損傷。

大量研究表明，氧化應(yīng)激能夠激活多條信號通路，從而介導(dǎo)抗氧化基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。Nrf2/Keap1信號通路是介導(dǎo)氧化應(yīng)激的一條重要通路，研究表明，Nrf2敲出小鼠更容易受到氧自由基的攻擊，造成氧化損傷［21-22］。此外，Nrf2/Keap1信號通路在肝臟疾病、癌癥以及一些氧化應(yīng)激相關(guān)疾病上起著重要的作用［23-24］。正常情況下，Nrf2在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與Keap1緊密結(jié)合，并快速降解。而在氧化應(yīng)激條件下，Keap1蛋白半胱氨酸殘基增多，從而引起Keap1結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而失去了與Nrf2結(jié)合的活性。細(xì)胞質(zhì)游離的Nrf2能夠轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，從而介導(dǎo)抗氧化基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［25］。Nrf2/Keap1信號通路下游涉及到多種抗氧化基因的表達(dá)，其中包括 GPx、SOD、CAT、過氧化物酶、硫氧還蛋白(Trx)、血紅素加氧酶(HO-1)以及醌氧化還原酶等抗氧化物酶［25］。Agca 等［26］研究表明，?；撬崮軌蚣せ頝rf2信號，從而緩解糖尿病大鼠腦氧化損傷。此外，體外試驗也證明了?；撬崽幚鞷AW 264.7巨噬細(xì)胞能夠增加Nrf2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，并上調(diào)Trx和HO-1等抗氧化基因的表達(dá)，從而緩解過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激［27］。在本試驗中，肝臟Keap1的表達(dá)沒有受到LPS和?；撬岬娘@著影響，LPS下調(diào)了肝臟Nrf2的表達(dá)，而添加?；撬犸@著緩解了LPS對Nrf2表達(dá)的抑制。由此可以推斷，?；撬峒せ盍薔rf2/Keap1信號通路，從而介導(dǎo)了抗氧化基因的表達(dá)，近增強了小鼠肝臟抗氧化能力并緩解了LPS誘導(dǎo)的肝臟損傷。

4 結(jié) 論

腹腔注射LPS誘導(dǎo)了小鼠肝臟損傷和氧化應(yīng)激，而添加2.5%的?；撬犸@著降低了LPS誘導(dǎo)小鼠的肝臟指數(shù)，且上調(diào)了肝臟GPx1和Nrf2的表達(dá)，對LPS誘導(dǎo)的肝臟損傷和氧化應(yīng)激均起到一定的緩解作用。

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