艾立川 于曉彤 王 嘉* 薛 敏，2吳秀峰 鄭銀樺 韓 芳

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，國家水產(chǎn)飼料安全評價(jià)基地，北京 100081;2.農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)是一類由配體激活的核受體轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族，包括3個(gè)亞型——α、β/δ和 γ，在脂肪細(xì)胞分化、脂肪代謝和脂肪沉積過程中起著重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控作用［1-2］。PPARs作為調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪代謝過程中的關(guān)鍵因子，其通過與某些基因上游特異的DNA反應(yīng)元件(peroxisome proliferator response element，PPRE)相互作用來調(diào)控基因的表達(dá)。近年來的研究表明PPARα在調(diào)節(jié)過氧化物酶體增值、能量代謝、脂肪代謝等過程中發(fā)揮著重要作用，PPARα可以調(diào)節(jié)與脂肪酸氧化相關(guān)酶基因的表達(dá)，被相應(yīng)的配體激活后可促進(jìn)脂肪酸的β氧化，調(diào)節(jié)細(xì)胞對脂肪酸的攝取、活化和代謝［3-5］。以往的研究表明，PPARα在體內(nèi)的許多組織和器官中均有表達(dá)［6］，其在脂肪代謝過程中發(fā)揮作用，同時(shí)也參與調(diào)控體內(nèi)的炎癥反應(yīng)［7］及膽紅素的體內(nèi)平衡［8］。

脂酶的主要作用是水解甘油三脂(triglyceride，TG)、磷脂和膽固醇脂等一些非水溶性物質(zhì)中的脂鍵，在脂肪的吸收、脂蛋白的代謝過程中發(fā)揮著重要作用，雖然甘油三脂脂酶家族各成員之間結(jié)構(gòu)相似，但是在脂質(zhì)代謝的過程中卻具備不同功能，這些成員包括脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)、肝脂酶(hepatic lipase，HL)、內(nèi)皮脂酶(endothelial lipase，EL)和胰脂酶(pancreatic lipase，PL)等［9-11］。LPL 是脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶之一，其生理功能是催化乳糜微粒(chylomicron，CM)和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)核心的TG分解為甘油和脂肪酸，以供組織氧化供能和貯存，LPL還參與VLDL和高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)之間的載脂蛋白和磷脂的轉(zhuǎn)換。HL是肝素化血漿中存在的一種脂酶，屬于與血液循環(huán)中內(nèi)源性TG代謝有關(guān)的酶之一，主要催化CM、VLDL代謝殘粒及HDL中的TG和磷脂的代謝。LPL、HL均為脂質(zhì)代謝中的關(guān)鍵酶，與機(jī)體的脂質(zhì)代謝及肥胖與否密切相關(guān)，不同組織器官其基因的表達(dá)水平的高低直接決定這些組織器官脂質(zhì)底物配額的多少［12］。LPL、HL有助于清除體內(nèi)過多的TG并與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，在心血管疾病研究領(lǐng)域是近幾十年來的研究熱點(diǎn)問題［13-14］。

與哺乳動(dòng)物不同，魚類能優(yōu)先利用脂類作為能源物質(zhì)，是研究脂質(zhì)代謝理想的試驗(yàn)材料。魚體脂肪的含量和脂肪酸的構(gòu)成是影響肉質(zhì)、口感以及營養(yǎng)價(jià)值的重要標(biāo)準(zhǔn)。西伯利亞鱘(Acipenser baerii)屬鱘形目，鱘科，是一類古老的軟骨硬鱗魚類，在魚類進(jìn)化史上占有重要地位，常常被作為魚類生物學(xué)的模型動(dòng)物［15］。同時(shí)，西伯利亞鱘是我國重要的經(jīng)濟(jì)魚類，其生長速度快，食用價(jià)值高，受到許多國家和地區(qū)消費(fèi)者的青睞。但是由于養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和飼料中脂類含量及構(gòu)成的不合理，其脂肪堆積的問題日漸突出，這不僅影響了肉質(zhì)的口感，同時(shí)也對親魚健康狀況和繁殖性能產(chǎn)生了影響。PPARα、LPL、HL均在脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、脂肪酸β氧化、脂蛋白分解等過程中發(fā)揮重要作用，有報(bào)道表明，不同種類及不同飽和度的脂肪酸可以通過影響PPARs而進(jìn)一步調(diào)控LPL mRNA在肝臟中的表達(dá)豐度［16］。因此，本研究擬通過簡并引物反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)相結(jié)合的方法，克隆西伯利亞鱘肝臟中 PPARα、LPL、HL基因的全長cDNA序列，并與其他物種進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹分析，為進(jìn)一步研究西伯利亞鱘脂肪代謝機(jī)理奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用西伯利亞鱘取自北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所房山基地。待試驗(yàn)魚被麻醉后，在冰盤上分離出肝臟組織，立即置于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI GenBank中已知其他物種的PPARα的氨基酸保守序列，利用CODEHOP原理，設(shè)計(jì)出簡并引物，克隆西伯利亞鱘PPARα基因的保守片段。再根據(jù)克隆出來的基因的保守片段，利用 Primer 5.0設(shè)計(jì)用于 3’-RACE 和 5’-RACE擴(kuò)增的特異性引物。LPL、HL基因參考 NCBI GenBank中其他鱘魚的基因保守序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增西伯利亞鱘LPL、HL核心序列的特異性引物。再根據(jù)克隆出來的核心序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)用于3’-RACE和5’-RACE擴(kuò)增的特異性引物。所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。本試驗(yàn)中所用到的引物序列及相應(yīng)的退火溫度(Tm)見表1。

1.3 總RNA的提取

取西伯利亞鱘的肝臟組織，經(jīng)液氮研磨后，采用TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑從肝臟中提取總RNA。將總RNA進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，顯示18S和28S條帶，檢驗(yàn)所提取的總RNA的完整性。并采用PowerwayTMXS2全波長酶標(biāo)儀(BioTek，美國)檢測其在260 nm處的吸光度值與在280 nm處的吸光度值的比值(A260/A280)，并對所提取的總RNA進(jìn)行定量。

表1 本試驗(yàn)中所用引物序列及相應(yīng)的退火溫度Table 1 Primer sequences and Tm used in this experiment

1.4 cDNA第1鏈合成和保守片段克隆

cDNA第1鏈的合成采用TaKaRa公司的PrimerScriptⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit試劑盒，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用大約 1.0μg肝臟總RNA，操作步驟參照說明書進(jìn)行。分別采用之前設(shè)計(jì)好的各基因的對應(yīng)引物進(jìn)行保守片段聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系包括合成的cDNA 第 1 鏈 1 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL，TaKa-Ra Ex taq 0.625 U，dNTP 200 μmol/L，上游、下游引物［P01F、L01F、H01F、P02R、L02R、H02R(表1)］各 0.4 μmol/L，加滅菌水至總體積 25 μL。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性 3 min，94℃，30 s，Tm，30 s，72℃，1 min;共 35個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下切取與目的序列大小一致的條帶，采用TaKaRa公司的 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0膠回收試劑盒對目的片段進(jìn)行純化，操作步驟按照說明書進(jìn)行。純化產(chǎn)物與PMD19-T Vctor(TaKaRa，大連)連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli)JM109感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa，大連)中，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選后，選取陽性克隆進(jìn)行測序(北京華大基因服務(wù)公司)。

1.5 3’-RACE 擴(kuò)增

根據(jù)得到的西伯利亞鱘 PPARα、LPL、HL的cDNA核心片段設(shè)計(jì)3’-RACE上游嵌套引物P3’01F、P3’02F、L3’01F、L3’02F、H3’01F、H3’02F(表 1)，下游引物采用 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0 試劑盒(TaKaRa，大連)所提供的引物，按照說明書進(jìn)行3’-RACE擴(kuò)增。首先稱取1.0 μg肝臟總 RNA，以 3’RACE Adaptor為引物合成cDNA第1鏈，然后以試劑盒提供的引物3’-RACE Outer Primer(表 1)分別與引物 P3’01F、L3’01F、H3’01F進(jìn)行首次 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94 ℃ 預(yù)變性 3 min，94 ℃，30 s，Tm，30 s，72℃，1.5 min;共 35個(gè)循環(huán);最后 72 ℃ 延伸10 min。再以1 000倍稀釋的Outer PCR產(chǎn)物為模板，分別以試劑盒提供的3’-RACE Inner Primer(表 1)和所設(shè)計(jì)的引物 P3’02F、L3’02F、H3’02F進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件與第1輪相同。對Inner PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳、切膠純化、克隆測序。

1.6 5’-RACE 擴(kuò)增

根據(jù)得到的西伯利亞鱘 PPARα、LPL、HL的cDNA核心片段和SMARTTMRACE cDNA Amplifiction Kit試劑盒(Clontech，美國)要求設(shè)計(jì)下游嵌套引物 P5’01R、P5’02R、L5’01R、L5’02R、H5’01R、H5’02R(表 1)，上游引物由試劑盒提供。稱取 1.0μg肝臟總 RNA、5’-CDS Primer A和SMARTⅡ A Oligo合成cDNA第1條鏈，以Advertange 2 PCR Enzyme System(Clontech，美國)、UPM 引物(表 1)和 P5’01R、L5’01R、H5’01R引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增采用 Touch Down PCR 程序:94 ℃，30 s，72 ℃，2 min;5個(gè)循環(huán);94 ℃，30 s，70 ℃ ，30 s，72 ℃ ，2 min;5 個(gè)循環(huán);94 ℃，30 s，68 ℃，30 s，72 ℃ ，2 min;25 個(gè)循環(huán);再以1 000倍稀釋首次PCR產(chǎn)物，以試劑盒提供的NUP 引物(表 1)、P5’02R、L5’02R、H5’02R 引物進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94℃，30 s，72 ℃，2 min;5 個(gè)循環(huán);94 ℃，30 s，70 ℃，30 s，72 ℃，2 min;5 個(gè)循環(huán);94 ℃，30 s，68 ℃，30 s，72℃，2 min;30個(gè)循環(huán)。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳、切膠純化、克隆測序。

1.7 序列分析、同源性比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

通過將測序所獲得的核心片段、3’和5’區(qū)域拼接獲得西伯利亞鱘肝臟中PPARα、LPL、HL基因cDNA的全長序列。將拼接結(jié)果與GenBank中的已知序列作blastx同源性分析，用DNAMAN(VERSION 5.2.2)軟件分析所得 cDNA 序列及開放閱讀框，預(yù)測編碼氨基酸序列。根據(jù)GenBank中已報(bào)道的各基因編碼氨基酸序列用Lasergene 7.0程序中MegAlign進(jìn)行多序列比對和一致性數(shù)值計(jì)算。采用 MEGA 5.1軟件，選擇鄰接法(neighbor joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［17］。

2 結(jié)果

2.1 西伯利亞鱘肝臟中 PPARα、LPL、HL基因全長cDNA序列

西伯利亞鱘肝臟中PPARα基因全長cDNA序列及其推測編碼的氨基酸序列見圖1。cDNA全長 1 736 bp，包括 158 bp的 5’非翻譯區(qū)、1 401 bp的開放閱讀框及177 bp的3’非翻譯區(qū);其中開放閱讀框編碼1個(gè)由466個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，預(yù)測其分子質(zhì)量為 52.3 ku，等電點(diǎn)為5.78，多聚腺甘酸(polyA)加尾信號為 AATAA。將該序列提交至GenBank獲得登錄號為KJ534588。

西伯利亞鱘肝臟中LPL全長cDNA序列及其推測編碼的氨基酸序列見圖2。cDNA全長1 760 bp，包括 163 bp的 5’非翻譯區(qū)、1 506 bp的開放閱讀框以及3’非翻譯區(qū)91 bp;其中開放閱讀框編碼1個(gè)由501個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，預(yù)測分子質(zhì)量為57.1 ku，等電點(diǎn) 8.54。polyA 加尾信號為AATAAA。將該序列提交至GenBank獲得登錄號為KJ720972。

西伯利亞鱘肝臟中HL全長cDNA序列及其推測編碼的氨基酸序列見圖3。cDNA全長1 740 bp，包括 124 bp的 5’非翻譯區(qū)、1 500 bp的開放閱讀框以及3’非翻譯區(qū)116 bp;其中開放閱讀框編碼1個(gè)由499個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，預(yù)測分子質(zhì)量為 56.4 ku，等電點(diǎn) 8.94。polyA 加尾信號為AATAAA。將該序列提交至GenBank獲得登錄號為KJ720973。

2.2 多序列比對分析

將西伯利亞鱘PPARα氨基酸序列與其他物種的PPARα氨基酸序列進(jìn)行比對，西伯利亞鱘PPARα氨基酸序列2個(gè)重要的功能區(qū)域——DNA結(jié)合區(qū)域(DBD)和配體結(jié)合區(qū)域(LBD)，與其他物種相比變化并不大。特別是DNA結(jié)合區(qū)域，只有少數(shù)氨基酸發(fā)生變化，結(jié)果見圖4。同源性分析表明，西伯利亞鱘 PPARα氨基酸序列與真鯛(Pagrus major)相似度最高，為82.4%;與斑馬魚(Danio rerio)、大西洋鮭(Salmo salar)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、雞(Gallus gallus)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)的相似度分別為78.4%、81.5%、75.5%、80.3%、76.3%、79.7%。

在西伯利亞鱘LPL、HL氨基酸序列中均發(fā)現(xiàn)有催化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)、4個(gè)保守的半胱氨酸殘基位點(diǎn)以及脂質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)和多肽“蓋”結(jié)構(gòu)。將西伯利亞鱘LPL氨基酸序列與其他物種的LPL氨基酸序列進(jìn)行相似度比對，結(jié)果見圖5。同源性分析表明，西伯利亞鱘LPL氨基酸序列與非洲爪蟾的相似度最高，為 66.9%;與鯉魚(Cyprinus carpio)、羅非魚(Oreochromis niloticus)、鱖魚(Siniperca chuatsi)、雞、小鼠、人的相似度分別為62.3%、60.3%、66.2%、64.3%、61.2%、61.2%。

圖1 西伯利亞鱘肝臟中PPARα全長cDNA序列和預(yù)測的氨基酸序列(GenBank登錄號KJ534588)Fig.1 Liver PPARα full length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Acipenser baerii(GenBank accession No.KJ534588)

將西伯利亞鱘HL氨基酸序列與其他物種的HL氨基酸序列進(jìn)行相似度比對，結(jié)果見圖6。同源性分析表明，西伯利亞鱘HL氨基酸序列與海龜(Chelonia mydas)的相似度最高，為67.1%;與金頭鯛(Sparus aurata)、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)、非洲爪蟾、雞、小鼠、人的相似度分別為59.3%、59.5%、62.8%、64.9%、55.9%、55.4%。

圖2 西伯利亞鱘肝臟中LPL全長cDNA序列和預(yù)測的氨基酸序列(GenBank登錄號KJ720972)Fig.2 Liver LPL full length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Acipenser baerii(GenBank accession No.KJ720972)

圖3 西伯利亞鱘肝臟中HL全長cDNA序列和預(yù)測的氨基酸序列(GenBank登錄號KJ720973)Fig.3 Liver HL full length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Acipenser baerii(GenBank accession No.KJ720973)

圖4 西伯利亞鱘與其他物種PPARα氨基酸序列比對結(jié)果Fig.4 Alignment results of PPARα amino acid sequences between Acipenser baerii and other species

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

PPARα氨基酸序列進(jìn)化樹結(jié)果見圖7。如圖所示，西伯利亞鱘PPARα以bootstrap值為100的支持度與陸生脊椎動(dòng)物形成一支，再以bootstrap值為100的支持度與其他魚類合并為一支。LPL氨基酸序列進(jìn)化樹結(jié)果見圖8。如圖所示，西伯利亞鱘以bootstrap值為100的支持度與史氏鱘(Acipenser schrenckii)形成一支，再與鱖魚(Siniperca chuatsi)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、羅非魚(Oreochromis niloticus)、鯉魚、斑點(diǎn)叉尾 (Ictalurus punctatus)形成一支，最后以bootstrap值為99的支持度與其他陸生脊椎動(dòng)物形成一支。HL氨基酸序列進(jìn)化樹結(jié)果見圖9。如圖所示，西伯利亞鱘與中華鱘(Acipenser sinensis)和史氏鱘形成一支，再以bootstrap值為82的支持度與金頭鯛、真鯛、斜帶石斑魚、日本鰻鱺(Anguilla japonica)形成一支，最后以bootstrap值為100的支持度其他陸生脊椎動(dòng)形成一支。

圖5 西伯利亞鱘與其他物種LPL氨基酸序列比對結(jié)果Fig.5 Alignment results of LPL amino acid sequences between Acipenser baerii and other species

3 討論

本研究中，我們成功克隆了西伯利亞鱘肝臟中PPARα基因全長cDNA序列，通過與其他物種的多序列比對發(fā)現(xiàn)，西伯利亞鱘PPARα與其他魚類及陸生脊椎動(dòng)物的同源性均大于78.4%，而且在從魚類到哺乳動(dòng)物的演化過程中DBD和LBD這2個(gè)重要的功能區(qū)域都具有較高的保守性，這與賈成霞等［18］在虹鱒中的報(bào)道類似。有意思的是，在系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果中顯示，西伯利亞鱘PPARα并沒有優(yōu)先與其他魚類的聚合分支形成一支，而是獨(dú)立形成一支，并優(yōu)先與其他高等陸生脊椎動(dòng)物匯成一支，再與魚類的分支聚合成一支，這說明西伯利亞鱘PPARα與陸生脊柱動(dòng)物的親緣關(guān)系比與魚類的親緣關(guān)系要近，在關(guān)于西伯利亞鱘的熱休克蛋白(HSP70)［19］以及生長激素(GH)、生長激素受體(GHR)基因［20］的報(bào)道中也存在類似的現(xiàn)象，這可能與鱘魚特殊的進(jìn)化地位有關(guān)。同時(shí)，本研究首次克隆了西伯利亞鱘肝臟中LPL和HL基因全長cDNA序列，通過比較西伯利亞鱘與人、小鼠、雞、爪蟾、魚類等LPL、HL氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)以及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)西伯利亞鱘LPL、HL基因與陸生脊柱動(dòng)物相似度均低于真骨魚類，這與親緣關(guān)系遠(yuǎn)近相一致，這也說明西伯利亞鱘LPL、HL在進(jìn)化過程中均相對保守。結(jié)構(gòu)功能分析表明，成熟的LPL和HL蛋白質(zhì)都有N-末端和C-末端2個(gè)結(jié)構(gòu)域，并且西伯利亞鱘LPL基因編碼的氨基酸序列存在與HL基因編碼的氨基酸序列相同的保守區(qū)域:脂質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)、催化位點(diǎn)、保守的半胱氨酸殘基位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)(圖5、圖6)，這也說明 LPL和HL起源祖先相同并且有著類似的作用機(jī)制。在與已知物種LPL和HL的氨基酸序列比對分析時(shí)發(fā)現(xiàn)絲氨酸-天冬氨酸-組氨酸(Ser-Asp-His)組成的三聯(lián)體催化中心與真骨魚類及其他脊椎動(dòng)物的N-末端區(qū)域高度保守，此位點(diǎn)主要負(fù)責(zé)水解TG［21］。

圖6 西伯利亞鱘與其他物種HL氨基酸序列比對結(jié)果Fig.6 Alignment results of HL amino acid sequences between Acipenser baerii and other species

內(nèi)源性脂肪酸及其代謝產(chǎn)物是PPARs的天然配體，激活后的PPARα與視黃醇X受體形成異源二聚體，通過結(jié)合在DNA序列中的特異性序列來調(diào)控參與脂肪酸β氧化相關(guān)酶的基因活化表達(dá)以及脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)酶的基因活化表達(dá)，如編碼脂肪酸結(jié)合蛋白、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、脂蛋白脂酶等基因［22］。在給脊椎動(dòng)物飼喂富含n-3高不飽和脂肪酸的飼料后，肝臟中脂肪酸β氧化增強(qiáng)，大量的氧化產(chǎn)物會進(jìn)一步促進(jìn)PPARs的表達(dá)［23］。戚曉紅等［24］研究表明，在發(fā)生肝細(xì)胞中毒性脂肪肝時(shí)，肝臟中PPARα的表達(dá)量減少，導(dǎo)致肝臟中脂肪酸代謝發(fā)生障礙，造成脂質(zhì)蓄積。LPL和HL是脂肪酶家族中重要的成員，它們直接參與生物體內(nèi)脂肪的代謝過程，是脂肪代謝中的關(guān)鍵酶［25］。在近期的研究中發(fā)現(xiàn)，草魚在饑餓48 h后，LPL基因表達(dá)量顯著提高，再次投喂，12 h后回到初始水平，說明草魚LPL基因的表達(dá)受到攝食狀況的調(diào)控［26］。梁旭方等［27］、Oku 等［28］在真鯛的試驗(yàn)中證實(shí)了LPL基因在成魚肝臟中存在營養(yǎng)誘導(dǎo)性表達(dá)，饑餓、高脂飼料都是其表達(dá)的誘導(dǎo)因子，但給真鯛飼喂高脂食物時(shí)并未對其腹腔腸系膜脂肪組織LPL基因的表達(dá)造成影響。鄭珂珂等［29］以5種不同脂肪水平的飼料飼喂瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)早期幼魚30 d后發(fā)現(xiàn)，肝臟LPL基因表達(dá)量隨著飼料脂肪水平的提高有上升的趨勢。早期的研究表明，離體小鼠巨噬細(xì)胞LPL基因表達(dá)可以受不同種類脂肪酸的影響，并證明PPARs受體參與此過程的調(diào)控［30］。梁旭方等［16］證實(shí)，真鯛肝臟LPL基因表達(dá)量的高低與飼料添加脂肪酸的不飽和度完全一致，說明脂肪酸通過氧化代謝來促進(jìn)PPARs基因的表達(dá)并進(jìn)一步促進(jìn)真鯛肝臟LPL基因的表達(dá)。此外，內(nèi)源性脂肪酸需要達(dá)到一定濃度才能激活PPARα，有證據(jù)表明VLDL可以通過分解提供大量的不飽和脂肪酸作為激活PPARα的配體，而VLDL的分解主要靠LPL、HL等脂蛋白脂肪酶的催化作用來進(jìn)行分解，因此LPL、HL的活性在激活PPARα過程中至關(guān)重要［31］。西伯利亞鱘作為一種古老的軟骨硬鱗魚，無論在物種保護(hù)還是在作為經(jīng)濟(jì)魚種的研究對象，均處于非常重要的地位，本試驗(yàn)成功克隆到西伯利亞鱘肝臟中PPARα、LPL、HL基因的全長cDNA序列，這為進(jìn)一步研究其脂肪代謝奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

圖7 西伯利亞鱘和其他物種PPARα氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類分析Fig.7 Cluster analysis of phylogenetic tree of PPARα amino acid sequence between Acipenser baerii and other species

圖8 西伯利亞鱘和其他物種LPL氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類分析Fig.8 Cluster analysis of phylogenetic tree of LPL amino acid sequence between Acipenser baerii and other species

圖9 西伯利亞鱘和其他物種HL氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類分析Fig.9 Cluster analysis of phylogenetic tree of HL amino acid sequence between Acipenser baerii and other species

4 結(jié) 論

①本試驗(yàn)成功克隆得到西伯利亞鱘肝臟中PPARα、LPL、HL基因的全長 cDNA序列，通過多序列比較發(fā)現(xiàn)其與其他物種對應(yīng)基因具有較高的相似性。

②通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，西伯利亞鱘PPARα與高等脊椎動(dòng)物的親緣關(guān)系較近，LPL、HL與魚類親緣較近。

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