王興名,郭莉,張志強(qiáng),張園,程文霞,王洪江△
c-met在新疆哈薩克族與漢族食管鱗癌組織及血清中的表達(dá)及意義
王興名1,郭莉2,張志強(qiáng)1,張園3,程文霞4,王洪江1△
目的探討新疆哈薩克族(哈族)與漢族食管鱗癌患者組織及血清中c-met蛋白的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法收集哈族和漢族食管鱗癌組織及其對應(yīng)的癌旁食管組織各50例,采用免疫組織化學(xué)法檢測組織中c-met蛋白的表達(dá);取以上食管鱗癌患者血清標(biāo)本,另擇哈族和漢族健康體檢者血清各40例,采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定血清中c-met蛋白的含量。結(jié)果c-met蛋白在哈族和漢族食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率分別高于其對應(yīng)的癌旁組織,且c-met蛋白在哈族和漢族食管鱗癌患者血清中的含量均分別高于其對應(yīng)的健康體檢者。食管鱗癌組織和血清中,c-met蛋白表達(dá)在不同腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期間差異有統(tǒng)計學(xué)意義,其中浸潤至深肌層及突破漿膜(T3+T4)高于浸潤黏膜及黏膜下層組(T1+T2),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,TNM分期ⅡB+Ⅲ期高于Ⅰ+ⅡA期;c-met蛋白表達(dá)在不同民族、性別、年齡、組織分化程度間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論cmet蛋白與哈族和漢族食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及分期均有關(guān),其在食管鱗癌組織和血清中的高表達(dá),可能預(yù)示食管癌易浸潤轉(zhuǎn)移,并提示臨床分期較晚。
食管腫瘤;癌,鱗狀細(xì)胞;原癌基因蛋白質(zhì)c-met;免疫組織化學(xué);酶聯(lián)免疫吸附測定
新疆哈薩克族(哈族)食管癌發(fā)病率明顯高于漢族[1-2],且以食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)為主。c-met蛋白是原癌基因c-met(prpto-oncogne c-met)表達(dá)產(chǎn)生的一種跨膜糖蛋白。多項研究顯示,c-met蛋白的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤性有關(guān)[3],但該蛋白在哈族和漢族食管鱗癌患者民族間表達(dá)差異的研究并不多見,并且該蛋白在食管鱗癌患者血清中表達(dá)水平的研究也不多見。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測新疆哈族和漢族食管鱗癌患者癌組織與對應(yīng)癌旁組織c-met蛋白的表達(dá)程度,酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測食管鱗癌患者及健康體檢者血清中該蛋白表達(dá)量,并分析c-met蛋白與兩民族食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的關(guān)系。
1.1 材料收集2010年1月—2012年12月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科手術(shù)切除標(biāo)本100例,每例患者均取得遠(yuǎn)隔癌旁組織作為對照,所選病例術(shù)后病理均證實為食管鱗狀細(xì)胞癌。其中漢族和哈族各50例,漢族年齡41~77歲,平均(57.00±3.06)歲;哈族年齡38~80歲,平均(58.00±2.17)歲;根據(jù)食管癌分期2010年(AJCC第七版)分期標(biāo)準(zhǔn),術(shù)后分期Ⅰ期10例,ⅡA期17例,ⅡB期27例,ⅢA期26例,ⅢB期11例,ⅢC期9例;其中有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各50例。所選入組的患者術(shù)前均未行放療及化療。上述食管鱗癌患者血清標(biāo)本由新疆腫瘤防治研究所標(biāo)本庫提供,另選擇漢族和哈族健康體檢者血清各40份作為健康對照,其中漢族和哈族男女性別比例均為1∶1,漢族年齡35~70歲,平均(55.38±4.49)歲,哈族年齡35~79歲,平均(57.81±5.86)歲。食管鱗癌患者與健康體檢者的年齡(t=1.102)、性別(χ2= 1.147)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。
1.2 標(biāo)本處理所有組織標(biāo)本術(shù)中離體30 min內(nèi)立即取材,取遠(yuǎn)隔5 cm以上癌旁食管組織作為對照,10%福爾馬林固定,石蠟包埋,用于常規(guī)病理診斷及免疫組織化學(xué)染色。血清標(biāo)本均為患者術(shù)前晨空腹靜脈血,未加抗凝劑,30 min內(nèi)送新疆腫瘤防治研究所標(biāo)本庫并立即處理,3 000 r/min離心10 min,分裝后于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?;健康體檢者血清采集、保存方法同上。
1.3 主要試劑及儀器c-met兔抗人單克隆抗體、通用二抗、SP試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物科技有限公司;Human c-met ELISA kit(EK0744)購自武漢博士德生物科技有限公司;美國Bio-rad酶標(biāo)儀;德國Ditabis恒溫振蕩器;德國sigma高速離心機(jī)。
1.4 實驗操作(1)免疫組織化學(xué)法。將標(biāo)本蠟塊制成4 μm厚連續(xù)石蠟切片。二甲苯脫蠟,水化;用3%H2O2乙醇溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶,高壓法抗原修復(fù),山羊血清進(jìn)行封閉。切片采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(S-P法)染色。c-met抗體的工作濃度為1∶100。選用已知陽性食管癌組織切片作為陽性對照,用PBS代替一抗作為陰性對照,染色步驟嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。(2)ELISA法。凍存標(biāo)本在室溫下緩慢平衡至室溫;設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測標(biāo)本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品;樣本孔中加入待測樣本,空白孔不加;除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃恒溫孵育。洗板,每孔加入底物,37℃避光孵育。滴加終止液并立即在450 nm波長處測定各孔的OD值。詳細(xì)操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。
1.5 結(jié)果判讀(1)免疫組織化學(xué)結(jié)果。由2名病理專業(yè)醫(yī)師在在完全不了解組織切片臨床和病理資料情況下判讀,并高倍鏡下隨機(jī)讀取5個視野,每個視野觀察細(xì)胞數(shù)不小于200個。c-met蛋白陽性表達(dá)定位于胞漿和(或)胞膜,陽性信號呈黃色、棕黃色、棕褐色顆粒樣物質(zhì)。根據(jù)陽性細(xì)胞比例(A)及染色強(qiáng)度(B)進(jìn)行陽性程度的判斷[4-5]。A判斷標(biāo)準(zhǔn)為同一視野下陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)的百分率,陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分,5%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%以上為4分;B判讀標(biāo)準(zhǔn):淡棕黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。以A×B結(jié)果作為c-met蛋白表達(dá)程度,乘積≤2為陰性(-),>2分為陽性(+)。(2)ELISA結(jié)果。使用美國Bio-rad酶標(biāo)儀,在450 nm波長處測定各孔的OD值,并連接計算機(jī)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得待測樣本中c-met蛋白含量值。
1.6 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,c-met蛋白在組織中陽性表達(dá)率之間的比較用χ2檢驗;c-met蛋白在血清中含量用表示,兩獨立樣本間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 c-met蛋白在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá)c-met蛋白在食管鱗癌組織及癌旁食管組織中的陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞漿,在癌組織中的染色呈彌漫分布,并可見少量淋巴細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞,胞漿呈棕黃色;癌旁組織中染色主要位于基底細(xì)胞層,細(xì)胞排列整齊。見圖1、2。c-met蛋白在哈族和漢族食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率均分別高于其在癌旁組織中的陽性表達(dá)率(均P<0.01),見表1。
Fig.1The positive expression of c-met in esophageal squamous cell carcinoma(×100)圖1 c-met在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)(×100)
Fig.2The positive expression of c-met in the adjacent tissues of carcinoma(×100)圖2 c-met在癌旁組織中的陽性表達(dá)(×100)
Tab.1Comparison of the expression of c-met protein between esophageal squamous cell carcinoma and the adjacent tissues of carcinoma in Kazakh and Han people表1 c-met蛋白在哈族和漢族食管鱗癌組織及癌旁組織中的陽性表達(dá)比較例(%)
2.2 食管鱗癌患者及健康體檢者血清c-met蛋白水平比較哈族和漢族食管鱗癌患者血清c-met蛋白水平均分別高于其對應(yīng)的健康體檢者(均P<0.01),見表2。
Tab.2Comparison of serum c-met protein between esophageal squamous cell carcinoma patients and healthy subjects表2 哈族和漢族食管鱗癌患者及健康體檢者血清c-met蛋白水平比較(μg/L,)
Tab.2Comparison of serum c-met protein between esophageal squamous cell carcinoma patients and healthy subjects表2 哈族和漢族食管鱗癌患者及健康體檢者血清c-met蛋白水平比較(μg/L,)
**P<0.01
組別食管鱗癌患者健康體檢者t n 50 40哈族108.59±11.01 63.25±9.10 21.384**漢族106.39±10.74 63.25±9.10 20.610**
2.3 c-met蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關(guān)系無論是在食管鱗癌組織中還是在血清中,c-met蛋白表達(dá)在不同腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期間差異有統(tǒng)計學(xué)意義,其中浸潤至深肌層及突破漿膜(T3+T4)高于浸潤黏膜及黏膜下層組(T1+T2),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,TNM分期ⅡB+Ⅲ期高于Ⅰ+ⅡA期;c-met蛋白表達(dá)在不同民族、性別、年齡、組織分化程度間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,見表3。
Tab.3The relationship between c-met protein and clinic pathological significance表3 c-met蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系
c-met蛋白是原癌基因c-met轉(zhuǎn)錄翻譯生成的一種跨膜糖蛋白,具有酪氨酸激酶活性,同時也是肝細(xì)胞生長因子(HGF)的受體[3]。該蛋白含有α、β兩個亞基,兩亞基通過二硫鍵連接形成異二聚體,α亞基位于胞外,β亞基跨膜,由于功能的不同分為3個結(jié)構(gòu)域:細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。其中細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(β亞基胞外區(qū)和α亞基)是配體識別部位,可以特異性識別并結(jié)合配體(HGF)。而胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域為β亞基C端(位于細(xì)胞內(nèi)),其具有酪氨酸激酶的活性,是多種信號分子相互作用的共同結(jié)合部位[6]。當(dāng)配體HGF與c-met受體結(jié)合后[7],細(xì)胞外β亞基的相應(yīng)位點被激活,信號傳導(dǎo)入胞內(nèi),使酪氨酸激酶(PTK)激活,從而導(dǎo)致cmet受體自身酪氨酸殘基(Tyr)磷酸化[8],同時啟動多種信號通路,如PI3K/Akt信號通路[9]、Ras和ERK/MAPK信號通路[10]等,從而促進(jìn)細(xì)胞的分化、分裂,并能夠調(diào)節(jié)多種器官組織的生長、發(fā)育,同時修復(fù)組織損傷。
本研究結(jié)果顯示,c-met蛋白在哈族和漢族食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率均分別高于其對應(yīng)的癌旁組織,且c-met蛋白在哈族和漢族食管鱗癌患者血清中的水平均分別高于其對應(yīng)的健康體檢者。提示該蛋白的表達(dá)與兩民族食管鱗癌發(fā)生有關(guān),這與劉春濤等[11]的研究結(jié)果基本一致。胡亮等[12]采用納米免疫磁珠方法檢測c-met蛋白在胰腺癌患者外周血清中表達(dá)時,也發(fā)現(xiàn)外周血c-met蛋白表達(dá)陽性;周韻斕等[13]通過RT-PCR方法檢測胃癌患者外周血細(xì)胞游離核酸標(biāo)志物的研究中,發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中c-met mRNA含量高于健康對照組。因此可以推測c-met蛋白的高表達(dá)與食管鱗癌發(fā)生存在密切關(guān)系,c-met蛋白在血清中的高表達(dá)可能提示兩民族食管鱗癌高發(fā)生、高復(fù)發(fā)風(fēng)險。
在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中,新生血管形成起至關(guān)重要的作用。c-met基因過度表達(dá)還可以促進(jìn)新生血管形成和基底膜破壞,促進(jìn)惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。而在HGF/c-met信號系統(tǒng)中,HGF不僅可以通過自分泌或旁分泌方法直接作用內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)腫瘤新生血管形成,還可以通過影響其他血管生長因子的水平,間接促進(jìn)腫瘤的血管生成[7]。Grugan等[14]研究發(fā)現(xiàn)通過增加HGF/c-met信號系統(tǒng)中HGF血液中的含量,可以促進(jìn)基底膜的破壞,加速惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
另外本研究發(fā)現(xiàn),c-met蛋白在組織和血清中的高表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。浸潤至深肌層及突破漿膜組(T3+T4)該蛋白在組織和血清中的含量均高于浸潤黏膜及黏膜下層組(T1+T2);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組該蛋白在組織和血清中的含量均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,提示該蛋白的高表達(dá)與食管鱗癌的侵襲性、轉(zhuǎn)移性有關(guān),其表達(dá)程度越高,提示侵襲性、轉(zhuǎn)移性風(fēng)險越大。并且隨TNM分期越晚,該蛋白陽性表達(dá)程度及血清含量越高,提示該蛋白的高表達(dá)可能對食管鱗癌的TNM分期有一定影響。c-met蛋白在血清中的含量可能在一定程度上反映浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病期早晚,且c-met在血清中的檢測較組織切片中檢測更加方便,并能在術(shù)前早期篩檢。
綜上所述,c-met蛋白與哈族和漢族食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移均有關(guān);c-met蛋白在食管鱗癌組織和血清中的的高表達(dá)可能預(yù)示食管鱗癌易浸潤轉(zhuǎn)移,并提示臨床分期較晚;該蛋白在組織及血清中的陽性表達(dá)可以作為食管鱗癌高轉(zhuǎn)移性、侵襲性的分子標(biāo)志物之一,而在血清中的檢測更加方便,有望成為早期篩檢指標(biāo)之一。
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(2014-08-10收稿2014-09-26修回)
(本文編輯陳麗潔)
The expression and significance of serum c-met in esophageal squamous cell carcinoma of two different nationalities in Xinjiang
WANG Xingming1,GUO Li2,ZHANG Zhiqiang1,ZHANG Yuan3,CHENG Wenxia4,WANG Hongjiang1△
1 Thoracic Surgery,Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University,Urumchi 830011,China;2 Medical Department,Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University;3 Xinjiang Research Institution of Cancer Prevention;4 Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Division of Chemotherapy△
ObjectiveTo explore the relationship between serum expression of c-met protein and clinic pathological features in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)of Kazakh and Han people.MethodsA total of 50 samples of ESCC and its corresponding adjacent tissues of Kazak and Han patients were collected.The expression of c-met protein was detected by immunohistochemistry assay.The serum c-met protein was detected in 40 Kazak and Han ESCC samples and 40 Kazak and Han controls using ELISA method.ResultsThe positive expression rates of c-met protein were higher in Kazak and Han esophageal squamous cell carcinoma patients than those in its corresponding adjacent tissues respectively.And the serum expression rates of c-met protein were higher in Kazak and Han esophageal squamous cell carcinoma patients than those of healthy controls.There were significant differences in the different tumor invasion,lymph node metastasis and TNM stage of esophageal squamous cell carcinoma tissue and serum between groups,in which the infiltrated deep muscle and serous breakthrough(T3+T4)were higher than the infiltration of the mucosa and submucosa group(T1+T2),with lymph node metastasis was higher than that without lymph node metastasis,and TNM stage ofⅡB+Ⅲwas higher than that ofⅠ+ⅡA. There was no significant difference in the expression of c-met protein between ethnicity,gender,age and degree of differentiation.ConclusionThe c-met protein expression is related to the occurrence and development,the invasion,metastasis and TNM stage of ESCC in Kazak and Han nationalities.The high expression of c-met protein in tissue and serum may indicate the invasion and metastasis of esophageal cancer and prompt a late clinical stage.
esophageal neoplasm;carcinoma,squamous cell;proto-ontogeny proteins c-met;immunohistochemistry; enzyme-linked immunosorbent assay
R735.1
A
10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.017
國家自然科學(xué)基金項目(81160271)
1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科(郵編830011),2內(nèi)三科;3新疆腫瘤防治研究所;4新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院放化療科
王興名(1987),男,碩士在讀,主要從事食管癌外科治療與基礎(chǔ)研究
△通訊作者E-mail:whj71210@sina.com