胡家平，莊建新，李勇，余永歡，胡慶紅，賴(lài)銀英，吳安濤

TNF-α和HSP70-2基因多態(tài)性與急性胰腺炎的相關(guān)性研究

胡家平，莊建新△，李勇，余永歡，胡慶紅，賴(lài)銀英，吳安濤

目的探討腫瘤壞死因子（TNF）-α和熱休克蛋白（HSP）70-2基因多態(tài)性與急性胰腺炎（AP）的相關(guān)性。方法運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RLFP）檢測(cè)72例AP患者(AP組)和71例正常人（對(duì)照組）的TNF-α及HSP70-2基因多態(tài)性。結(jié)果AP組與對(duì)照組的TNF-α基因型和等位基因比例間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AP組中，重型胰腺炎（SAP）和輕型胰腺炎（MAP）的TNF-α基因型和等位基因間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNF-α和HSP70-2基因AA型與GA+GG型患者的白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白（CRP）、淀粉酶、三酰甘油、血糖差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AP組的HSP70-2基因GA+GG型患者比例高于對(duì)照組（69.4%vs 49.3%），AP組攜帶的G等位基因比例高于對(duì)照組（46.5%vs 31.7%）,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AP組中，SAP的GA+GG型比例高于MAP（81.0%vs 53.3%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而G等位基因在SAP和MAP間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論TNF-α基因多態(tài)性與AP不相關(guān)，HSP70-2基因多態(tài)性與AP相關(guān)，攜帶G等位基因發(fā)生重癥AP的可能性增大，可能是重癥AP的易感因素之一。

腫瘤壞死因子α；HSP70熱休克蛋白質(zhì)類(lèi)；胰腺炎；基因多態(tài)性；HSP70-2；多態(tài)性，限制性片斷長(zhǎng)度；聚合酶鏈反應(yīng)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是指多種病因引起的胰酶激活，繼以胰腺局部炎癥反應(yīng)為主要特征，伴或不伴有其他器官功能改變的疾病。臨床上，大多數(shù)AP患者的病程呈自限性，20%～30%的患者臨床過(guò)程兇險(xiǎn)，病死率可達(dá)5%～10%[1]。目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，研究發(fā)現(xiàn)在AP早期，胰腺星狀細(xì)胞中的促炎因子表達(dá)上調(diào)[2]。遺傳因子特別是AP相關(guān)的炎癥因子，可能是胰腺損傷甚至是AP嚴(yán)重程度和炎癥進(jìn)展中一個(gè)重要的易感因素。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)數(shù)量巨大，分布廣，目前被認(rèn)為是最有價(jià)值的遺傳標(biāo)記[3]。有研究報(bào)道腫瘤壞死因子（TNF）-α和熱休克蛋白（HSP）70-2基因多態(tài)性與多種炎癥性疾病有關(guān)[4-5]，但關(guān)于TNF-α和HSP70-2基因多態(tài)性與AP易感性的相關(guān)研究較少，本研究檢測(cè)TNF-α及HSP70-2的基因多態(tài)性，并探討其與AP的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2012年6月—2013年2月在我院就診的發(fā)病72 h內(nèi)的AP患者72例作為AP組，年齡（54.9± 14.1）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)胰腺疾病學(xué)組制定標(biāo)準(zhǔn)[1]及中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)會(huì)胰腺外科學(xué)組制定標(biāo)準(zhǔn)[6]。其中輕型胰腺炎（MAP）30例，重型胰腺炎（SAP）42例。選擇同期我院查體健康人71例為對(duì)照組，年齡（50.6± 13.9）歲。

1.2 TNF-α及HSP70-2基因多態(tài)性檢測(cè)

1.2.1 引物擴(kuò)增采研究對(duì)象外周血3 mL于EDTA抗凝管。采用經(jīng)典苯酚-氯仿提取法從全血中提取基因組DNA，溶解于50 μLTE液中，-20℃冰箱保存。參考文獻(xiàn)[7]及GenBank設(shè)計(jì)引物，由Invitrogen公司合成。TNF-α引物:上游5′-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3′，下游5′-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3′，擴(kuò)展片段長(zhǎng)度107 bp；HSP70-2引物:上游5′-CAGCAAAGTCCTTGAGTCCC-3′，下游5′-TCCGAAGGACTGGAGCTCTTG-3′，擴(kuò)展片段長(zhǎng)度2 075 bp。TNF-α和HSP70-2 PCR反應(yīng)體系均為50 μL：取DNA模板1 μL，分別加入TNF-α和HSP70-2引物，然后加入TaqDNA合成酶。擴(kuò)增條件：（1）TNF-α。95℃預(yù)變性5 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃45 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min；（2）HSP70-2。94℃預(yù)變性5 min；95℃1 min，60℃1 min，72℃3 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.2.2 酶切反應(yīng)取10 μLTNF-αPCR產(chǎn)物加入NcoⅠ限制性內(nèi)切酶，10 μL HSP70-2 PCR產(chǎn)物加入PstⅠ限制性內(nèi)切酶，均在37℃恒溫水浴鍋過(guò)夜。于2%瓊脂糖凝膠電泳下分析TNF-α酶切產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳下分析HSP70-2酶切產(chǎn)物，與標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，基因型及等位基因頻率采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用或M（P25，P75）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或非參Z檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α、HSP70-2基因PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果TNF-α基因PCR產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ酶切后凝膠電泳結(jié)果顯示GG型（87 bp+20 bp，由于20 bp太小無(wú)法顯示，但不影響結(jié)果判定）、GA型（107 bp+87 bp+20 bp，圖中未見(jiàn)此型）和AA型（107 bp）；HSP70-2基因PCR產(chǎn)物經(jīng)PstⅠ酶切后凝膠電泳結(jié)果顯示GG型（1 139 bp+936 bp）、GA型（2 075 bp+1 139 bp+ 936 bp）和AA型（2 075 bp），見(jiàn)圖1、2。

Fig.1TNF-α polymorphism in the result of 2%sepharose electrophoresis圖1 TNF-α基因多態(tài)性2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Fig.2HSP70-2 polymorphism in the result of the 1%sepharose electrophoresis圖2 HSP70-2基因多態(tài)性1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 TNF-α基因多態(tài)性與AP易感性的關(guān)系A(chǔ)P組與對(duì)照組的TNF-α基因型和等位基因比例間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1；AP組中，SAP組和MAP組的TNF-α基因型和等位基因間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

Tab.1Comparison of TNF-α genotype and allele between AP group and control group表1 AP組和對(duì)照組TNF-α基因型和等位基因比較例（%）

Tab.2Comparison of TNF-α genotype and allele between SAP and MAP groups表2 SAP組和MAP組的TNF-α基因型和等位基因比較例（%）

2.3 不同TNF-α基因型患者的有關(guān)臨床檢驗(yàn)參數(shù)比較TNF-α基因AA型與GA+GG型患者的白細(xì)胞、CRP、淀粉酶、三酰甘油、血糖差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

Tab.3Comparison of clinical laboratory parameters between AP patients with different TNF-α genotypes表3 不同TNF-α基因型AP患者的臨床檢驗(yàn)參數(shù)比較

2.4 HSP70-2基因多態(tài)性與AP易感性的關(guān)系A(chǔ)P組的HSP70-2基因GA+GG型患者比例高于對(duì)照組，AP組攜帶的G等位基因比例高于對(duì)照組（均P＜0.05），見(jiàn)表4。AP組中，SAP組的GA+ GG型比例高于MAP組；而G等位基因在SAP組和MAP組間無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)表5。

Tab.4Comparison of HSP70-2 genotype and allele between AP group and control group表4 AP組和對(duì)照組HSP70-2基因型和等位基因比較例（%）

2.5 不同HSP70-2基因型患者的有關(guān)臨床檢驗(yàn)參數(shù)比較HSP70-2基因AA型與GA+GG型患者的白細(xì)胞、血糖、CRP、淀粉酶、三酰甘油差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表6。

Tab.5Comparison of HSP70-2 genotype and allele between SAP and MAP groups表5 SAP組和MAP組HSP70-2基因型和等位基因比較例（%）

Tab.6Comparison of clinical laboratory parameters between AP patients with different HSP70-2 genotypes表6 不同HSP70-2基因型AP患者的臨床檢驗(yàn)參數(shù)比較

3 討論

AP是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病之一，是因早期炎癥使胰腺腺泡中的胰酶過(guò)早激活導(dǎo)致自身組織消化的過(guò)程[8]，其病理過(guò)程包括水腫、出血和壞死。TNF-α在AP的血清中是可以被檢測(cè)出來(lái)的。在炎癥反應(yīng)早期，TNF-α可以激活中性粒細(xì)胞，促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)釋放，在AP的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用[9]。本研究結(jié)果顯示：AP組與對(duì)照組的TNF-α基因型和等位基因無(wú)明顯差異；輕癥和重癥AP間也無(wú)明顯差異，雖然GG型比例在AP中所占比例較高（72.2%，52/72）；且不同基因型的血液檢測(cè)指標(biāo)亦無(wú)明顯差異，提示TNF-α基因的多態(tài)性可能與AP發(fā)病、嚴(yán)重程度及血液指標(biāo)無(wú)關(guān)。與?zhan等[10]、Yang等[11]的研究結(jié)論基本一致。但也有不一致的研究，Balog等[7]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α的308A位點(diǎn)基因多態(tài)性是SAP的影響因素，其認(rèn)為基因型檢測(cè)可以預(yù)測(cè)輕重癥AP的過(guò)程和預(yù)后。Dianliang等[12]研究表明TNF-α-308位點(diǎn)多態(tài)性與AP不相關(guān)，但與AP的膿毒血癥相關(guān)。以上研究結(jié)果的不同可能與不同種族、地域及樣本量差異有關(guān)，尚需開(kāi)展多中心、大樣本的試驗(yàn)進(jìn)行研究。

HSP70-2蛋白作為轉(zhuǎn)換蛋白的分子伴侶，參與受損蛋白質(zhì)的修復(fù)，使其恢復(fù)活性，從而在蛋白水平起到預(yù)防、保護(hù)的作用[13]，在受到炎癥、受熱、缺血、缺氧或代謝性毒物等因素刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)迅速表達(dá)HSP70-2[14]。本研究結(jié)果顯示：AP組GA+GG型比例高于對(duì)照組；AP組攜帶G等位基因的比例高于對(duì)照組。AP組中SAP的GA+GG型比例高于MAP；而G等位基因在SAP和MAP間無(wú)明顯差異。Balog等[7]研究發(fā)現(xiàn)，重癥AP患者攜帶HSP-70-2等位基因G的比例高于輕癥AP患者和健康人群，而具有AA型基因的AP，很少發(fā)展為重癥胰腺炎，HSP70-2等位基因G是急性重癥胰腺炎的危險(xiǎn)因素，與本研究結(jié)果一致。

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（2014-07-15收稿2014-09-02修回）

（本文編輯閆娟）

Polymorphisms of TNF-α gene and HSP70-2 gene in patients with acute pancreatitis

HU Jiaping,ZHUANG Jianxin△,LI Yong,YU Yonghuan,HU Qinghong,LAI Yinying,WU Antao
The First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China△

ObjectiveTo investigate the association of tumor necrosis factor(TNF)-α,heat shock protein(HSP)70-2 gene polymorphisms and susceptibility of acute pancreatitis(AP).MethodsUsing case-control method，The gene polymorphism of TNF-α and HSP70-2 was detected by PCR-RLFP in 72 patients with AP and 71 healthy controls.Results There were no significant differences in proportion of TNF-α genotype and alleles between AP and control groups(P＞0.05). There were no significant differences in TNF-α genotype and alleles between severe acute pancreatitis(SAP)and light acute pancreatitis(MAP)of AP group(P＞0.05).There were no significant differences in white blood cell count,C-reactive protein(CRP),amylase,three acyl glycerin and glucose between TNF-a and HSP70-2 gene of AA type and GA+GG type patients(P＞0.05).The HSP70-2 genotype GA+GG proportion was significantly higher in AP group than that of control group（69.4%vs 49.3%).The ratio of patients with G allele was significantly higher in AP group than that of control group（46.5% vs 31.7%).The ratio of patients with GA+GG type AP was significantly higher in SAP patients than that of MAP patients of AP group（81.0%vs 53.3%).There was no significant difference in G allele between SAP and MAP patients(P＞0.05). ConclusionTNF-α polymorphisms is not associated with acute pancreatitis.There is an association between HSP70-2 polymorphisms and acute pancreatitis.Carrying the G allele increases the possibility of a severe acute pancreatitis，which is one of the genetic susceptibility factors of severe acute pancreatitis.

tumor necrosis factor-alpha；HSP70 heat-shock proteins；pancreatitis；genetic polymorphism；HSP70-2；polymorphism,restriction fragment length;polymerase chain reaction

R576

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.015

江西省科技廳支撐計(jì)劃

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科五病區(qū)（郵編330006）

胡家平（1967），男，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，碩士，主要從事胃腸腫瘤研究

△通訊作者E-mail：zjx136@qq.com