馬明坤，閆衛(wèi)利，魏葆琳，蔣志云，李桐，溫學(xué)紅△

清熱合劑對(duì)上呼吸道感染常見致病菌的體外抑菌試驗(yàn)

馬明坤1，閆衛(wèi)利1，魏葆琳2，蔣志云1，李桐1，溫學(xué)紅1△

目的觀察清熱合劑對(duì)上呼吸道感染常見致病菌的體外抑菌活性。方法上呼吸道感染常見致病菌163株中不產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）革蘭陰性菌74株（大腸埃希菌33株，肺炎克雷伯菌24株，銅綠假單胞菌17株）；產(chǎn)ESBLs革蘭陰性菌10株（大腸埃希菌6株，肺炎克雷伯菌4株）；革蘭陽性菌79株[耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）11株、甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）46株，肺炎鏈球菌22株]。采用瓊脂稀釋法對(duì)清熱合劑進(jìn)行定量抑菌試驗(yàn)，配制含有不同藥物濃度的瓊脂平板，在平板上接種待測(cè)菌株菌懸液，孵育后觀察含藥平板，記錄最低抑菌濃度（MIC）。結(jié)果清熱合劑對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌的MIC90分別為88、176、22 g/L，其對(duì)產(chǎn)ESBLs與不產(chǎn)ESBLs革蘭陰性菌的抑菌效果一致；不同濃度藥物對(duì)銅綠假單胞菌的累積抑菌率均最高。清熱合劑對(duì)MSSA、MRSA和肺炎鏈球菌等革蘭陽性菌的MIC90分別為11、11、22 g/L，MRSA的MIC90與MSSA相同，但MIC50略高于MSSA；不同濃度藥物對(duì)MSSA和MRSA的累積抑菌率均高于肺炎鏈球菌，對(duì)MSSA與MRSA的累積抑菌率相近。結(jié)論清熱合劑對(duì)上呼吸道感染常見的致病菌除肺炎克雷伯菌之外均有一定的抑菌作用，對(duì)革蘭陽性菌的抑菌效果明顯優(yōu)于革蘭陰性菌。

呼吸道感染；微生物敏感性試驗(yàn)；革蘭陰性菌；革蘭陽性菌；致病菌；瓊脂稀釋法；清熱合劑

上呼吸道感染（upper respiratory tract infection, URTI）是臨床上常見的感染性疾病，是鼻腔、咽或喉部急性炎癥的概稱[1]，多由病毒引起，細(xì)菌感染常繼發(fā)于病毒感染。中醫(yī)藥治療URTI的效果在臨床上得到了肯定。目前，針對(duì)金黃色葡萄球菌的中藥體外試驗(yàn)的研究較多，很多中藥單體如黃連、大黃等對(duì)其均有不同程度的抑菌作用[2-3]。但是專門針對(duì)URTI常見致病菌的中藥抑菌試驗(yàn)的相關(guān)研究仍較少，尤其是中藥復(fù)合制劑體對(duì)上呼吸道感染的體外抑菌試驗(yàn)尚少見報(bào)道。本研究采用的清熱合劑是由金銀花、連翹、鉤藤等組成的復(fù)合制劑，主要研究清熱合劑對(duì)URTI的多種致病菌的體外抑菌作用，并對(duì)抑菌效果進(jìn)行了橫向比較分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料（1）菌株。2012年11月—2013年4月我院檢驗(yàn)科細(xì)菌室分離的痰或咽拭子標(biāo)本中的細(xì)菌共163株，其中不產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-actamases,ESBLs）革蘭陰性菌74株（大腸埃希菌33株，肺炎克雷伯菌24株，銅綠假單胞菌17株）；產(chǎn)ESBLs革蘭陰性菌10株（大腸埃希菌6株，肺炎克雷伯菌4株）；革蘭陽性菌79株[耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）11株、甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA）46株，肺炎鏈球菌22株]。細(xì)菌鑒定采用法國生物梅里埃公司VITEK 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀。（2）中藥。清熱合劑是由我院藥劑科制備的全成分配方顆粒，符合《天津市中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（暫行）》。主要成分：金銀花、連翹、鉤藤、黃芩、板藍(lán)根、桔梗、前胡、生甘草、廣藿香、荊芥等14味中藥。每袋6.25 g，溶于9 mL生理鹽水，漩渦混勻器混勻，121℃高壓滅菌20 min備用。（3）培養(yǎng)基。M-H瓊脂購自法國生物梅里埃公司。（4）質(zhì)控菌種。本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、ATCC25923購自天津市臨檢中心。

1.2 方法采用瓊脂稀釋法進(jìn)行定量抑菌試驗(yàn)。

1.2.1 含藥平板制備按照M-H瓊脂說明書配制瓊脂，121℃高壓滅菌20 min，冷卻至50℃左右時(shí)在超凈工作臺(tái)中平板振蕩器上加入中藥溶液，針對(duì)革蘭陰性菌配制成終濃度為176.00、88.00、44.00、22.00、11.00、5.50 g/L的M-H瓊脂平板，針對(duì)革蘭陽性菌配制成22.00、11.00、5.50、2.75、1.38、0.69 g/L的M-H瓊脂平板。鏈球菌抑菌試驗(yàn)需在高壓后的M-H瓊脂冷卻至50℃左右時(shí)，先加入5%（V/V）綿羊血，再按不同濃度加入中藥液，制成含藥血M-H平板。同時(shí)設(shè)不接種菌液的平板作為無菌對(duì)照，在不含中藥的M-H平板接種質(zhì)控菌株菌液作為生長(zhǎng)對(duì)照。

1.2.2 菌懸液制備將163株待測(cè)菌株制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，再?∶10稀釋后接種1 μL于瓊脂平板表面，每點(diǎn)菌量約為1×104CFU。

1.2.3 培養(yǎng)與觀察接種后的平板置于35℃孵育箱中，接種鏈球菌的平板置于5%CO2培養(yǎng)箱中孵育16～20 h。若無菌對(duì)照不生長(zhǎng)，生長(zhǎng)對(duì)照有菌落生長(zhǎng)則試驗(yàn)有效，進(jìn)而觀察含藥平板，確定最低抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果

2.1 清熱合劑對(duì)革蘭陰性菌的抑菌作用清熱合劑對(duì)革蘭陰性菌的MIC90由低到高依次是銅綠假單胞菌＜大腸埃希菌＜肺炎克雷伯菌。清熱合劑對(duì)產(chǎn)ESBLs與不產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的抑菌效果一致，見表1。

Tab.1The antimicrobial effect of the compound preparation on 84 strains of Gram-negative bacteria表1 清熱合劑對(duì)84株革蘭陰性菌的抑菌作用（g/L）

2.2 清熱合劑對(duì)革蘭陽性菌的抑菌作用清熱合劑對(duì)MSSA、MRSA和肺炎鏈球菌的MIC90均低于革蘭陰性菌。MRSA的MIC90與MSSA相同，但MIC50略高于MSSA，見表2。

Tab.2The antimicrobial effect of the compound preparation on 79 Gram-positive bacteria in vitro表2 清熱合劑對(duì)79株革蘭陽性菌的抑菌作用（g/L）

2.3 清熱合劑對(duì)革蘭陰性菌的累積抑菌率各個(gè)不同濃度的清熱合劑對(duì)銅綠假單胞菌的累積抑菌率均最高。其次是大腸埃希菌，對(duì)肺炎克雷伯菌的累積抑菌率最低，見表3。

2.4 清熱合劑對(duì)革蘭陽性菌的累積抑菌率各個(gè)不同濃度的清熱合劑對(duì)MSSA和MRSA的累積抑菌率均高于肺炎鏈球菌，不同濃度的清熱合劑對(duì)MSSA與MRSA的累積抑菌率相近，見表4。

3 討論

上呼吸道感染屬于中醫(yī)學(xué)外感風(fēng)熱，溫病范疇，為溫病初起,風(fēng)熱表證,邪在衛(wèi)分,邪正相爭(zhēng)。游思湘等[4]研究顯示復(fù)方黃連注射劑對(duì)耐藥性金黃色葡萄球菌具有明顯體外抑菌和耐藥抑制作用，其MIC為7.8 g/L。孫濤等[5]研究表明川貝母止嗽顆?？刹煌潭鹊貙?duì)革蘭陽性、革蘭陰性臨床分離菌株發(fā)揮體外抑菌作用。我院的復(fù)方制劑清熱合劑是由14味中藥制成的，以銀翹散為基礎(chǔ)加減,方中金銀花、連翹清熱解毒，輕宣透表，為主藥；荊芥、薄荷辛散表邪，透熱外出，為輔藥；黃芩、板藍(lán)根、桔梗、前胡等合用，清熱解毒，利咽散結(jié)，宣肺祛痰；藿香、厚樸芳香辟穢，行氣化濕，疏利氣機(jī)；拳參、鉤藤清熱鎮(zhèn)驚熄風(fēng)；甘草調(diào)和諸藥。全方共奏疏散風(fēng)熱，清熱解毒，芳香化濕，鎮(zhèn)驚熄風(fēng)之功。14味中藥對(duì)于風(fēng)熱感冒，溫病初起之癥均有一定效果。

Tab.3The accumulated antibacterial rate of the compound preparation on 84 Gram-negative bacteria in vitro表3 清熱合劑對(duì)84株革蘭陰性菌的累積抑菌率

Tab.4The accumulated antibacterial rate of the compound preparation on 79 Gram-positive bacteria in vitro表4 清熱合劑對(duì)79株革蘭陽性菌的累積抑菌率

本研究結(jié)果顯示，清熱合劑對(duì)銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌3種革蘭陰性菌的MIC90依次升高，其對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果最好。另外，各個(gè)不同濃度的清熱合劑對(duì)銅綠假單胞菌的累積抑菌率也最高，其次是大腸埃希菌，對(duì)肺炎克雷伯菌抑菌效果最差。清熱合劑對(duì)產(chǎn)ESBLs革蘭陰性菌與不產(chǎn)ESBLs革蘭陰性菌的抑菌效果相近，與劉東梅等[6]研究結(jié)果一致，提示中藥的抑菌作用原理與化學(xué)抗菌藥物不同，與細(xì)菌是否產(chǎn)酶無關(guān)，可能與中藥對(duì)耐藥菌株的質(zhì)粒消除作用有關(guān)[7]。但本研究中清熱合劑對(duì)產(chǎn)ESBLs和不產(chǎn)ESBLs兩種大腸埃希菌的MIC均低于秦靜英等[8]的研究結(jié)果，原因可能是后者使用的為單方黃芩苷，本研究的制劑為復(fù)合制劑，其他成分的存在增強(qiáng)了黃芩的抑菌作用。另外，本研究中清熱合劑對(duì)MSSA、MRSA和肺炎鏈球菌等革蘭陽性菌的抑菌效果明顯優(yōu)于革蘭陰性菌，MSSA、MRSA的累積抑菌率均高于肺炎鏈球菌。MRSA的MIC90值與MSSA相同，但MIC50值略高于MSSA，提示清熱合劑對(duì)MRSA的抑菌效果略差于MSSA，但仍有較高的活性，這與尉景娟等[9]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，清熱合劑對(duì)上呼吸道感染常見的致病菌除肺炎克雷伯菌之外均有一定的抑菌作用，研發(fā)有效的中藥復(fù)合制劑將有助于臨床感染疾病的治療。但由于本文選取的標(biāo)本來源于上呼吸道感染患者痰及咽拭子，分離出的產(chǎn)ESBLs的革蘭陰性菌和MRSA數(shù)量較少，有待今后增大樣本量以及對(duì)產(chǎn)酶菌的專項(xiàng)研究。

[1]Tian W,Ding N.Analysis of the antibiotics rational usage in patients with acute upper respiratory tract infection in emergency department[J].Journal of Clinical Emergency Call(China),2012,13(2): 89-93.[田瑋，丁寧.急性上呼吸道感染患者臨床應(yīng)用抗菌藥物合理性的綜合分析[J].臨床急癥雜志,2012,13(2):89-93].

[2]Tian YB,Chen ZH,Yang MH,et al.In vitro bacteriostatic investigation of 16 Chinese Medical Formula decoction on MRSA and MSSA [J].Chin Hosp Pharm J,2009,29(11):897-899[田應(yīng)彪，陳澤慧，楊名慧，等.16種中藥水煎液對(duì)MRSA和MSSA體外抑菌試驗(yàn)觀察[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2009,29(11):897-899].doi:10.3321/j. issn.1001-5213.2009.11.012.

[3]Ren SQ,Yang JZ,Wang CY.The study of the antibacterial activity of combined application of rhizoma coptidis，rhubarb and sophora flavescens ait On MRSA in vitro[J].Heibei Medical Journal,2011,33(15): 2253-2254.[任書青,楊繼章,王長(zhǎng)友.黃連、大黃和苦參聯(lián)合應(yīng)用對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性研究[J].河北醫(yī)藥，2011,33(15): 2253-2254].doi：10.3969/j.issn.1002-7386.2011.15.005.

[4]You SX,He XR,Meng HB,et al.Study on the in vitro bacteriostasis effect and resistance inhibition of compound recipe Chinese goldthread injection[J].Chinese Journal of Veterinary Medicine,2012,48 (8):65-67.[游思湘，何湘蓉，孟海波，等.復(fù)方黃連注射劑的體外抑菌和耐藥抑制作用研究[J].中國獸醫(yī)雜志，2012,48(8):65-67]. doi:10.3969/j.issn.0529-6005.2012.08.027.

[5]Sun T,Peng C,Wan F,et al.The study of in vitro antibacterial activity of Chuanbeimu Zhisou granule[J].Pharmacy and Clinic of Chinese Materia Medica,2013,4(3):33-34.[孫濤，彭成，萬峰，等.川貝母止嗽顆粒的體外抗菌作用研究[J].中藥與臨床，2013,4(3):33-34].

[6]Liu DM,Du SB,Qie HQ,et al.Traditional Chinese medicine on the ultra broad spectrum beta lactamase bacteria in vitro bacteriostasis experiment[J].Journal of Hebei TCM and Pharmacology,2008,23 (2):34-35.[劉東梅，杜士卜，郄會(huì)卿,等.中藥對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2008,23(2):34-35].doi:10.3969/j.issn.1007-5615.2008.02.026.

[7]Yang MW,Lu FE,Xu LJ,et al.Elimination Effect of Viola Yedoensis Makino on Plasmid in Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus[J].Research of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,2009,1(1):27-28.[楊明煒,陸付耳,徐麗君,等.紫花地丁對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥質(zhì)粒的消除作用[J].中西醫(yī)結(jié)合研究,2009,1(1):27-28].

[8]Qin JY,Li XH,Huang YQ,et al.Inhibitory effect of Chinese medicine extract on sensitive and resistant E.coli[J].J Mod Med Health, 2013,29(10):1477-1478.[秦靜英，李曉華，黃衍強(qiáng),等.中藥提取物對(duì)敏感性和耐藥性大腸桿菌的抑制作用[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2013, 29(10):1477-1478].doi:10.3969/j.issn.1009—5519.2013.10.017.

[9]Wei JJ,Li HF,Su JR.Eight kinds of traditional Chinese medicine monomer on the ultra broad spectrum beta lactamase e.coli and methicillin-resistant staphylococcus aureus in vitro antibacterial activity of study[J].Chin J Clinicians(Electronic Edition),2011,5(2): 540-542.[尉景娟,李惠芬,蘇建榮.八種中藥單體對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2011,5(2):540-542]. doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2011.02.055.

（2013-12-16收稿2014-05-28修回）

（本文編輯陳麗潔）

In vitro antibacterial test of Chinese medicine compound preparation for common pathogenic bacteria in upper respiratory tract infection

MA Mingkun1,YAN Weili1,WEI Baolin2,JIANG Zhiyun1,LI Tong1,WEN Xuehong1△
1 Department of Clinical Laboratory,2 Department of Pulmonary Medicine，the Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300150,China△

ObjectiveTo observe the antimicrobial effect of a kind of Chinese medicine Qingre compound preparation on the common pathogenic bacteria of upper respiratory tract infection(URTI).MethodsA total of 163 common pathogenic bacteria of URTI was selected in this study,including 74 non extended-spectrum β-lactamases(ESBLs)-producing Gram-negative bacteria(33 Escherichia coli,24 Klebsiella pneumonia and 17 Pseudomonas aeruginosa),10 ESBLs-producing Gram-negative bacteria(6 Escherichia coli and 4 Klebsiella pneumoniae)and 79 Gram-positive bacteria[11 methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA),46 methicillin-sensitive Staphylococcus aureus and 22 Streptococcus pneumoniae].Agar dilution method was adopted to perform the quantitative drug sensibility test.Agar plates that contained different concentrations of Qingre compound preparation were prepared.The bacterial suspension was planted on the plates.Then we observed the plates after incubation,and recorded the minimum inhibitory concentration(MIC).ResultsThe antimicrobial rates of Qingre compound preparation were 88,176 and 22 g/L for MIC90 of Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae, and Pseudomonas aeruginosa.The antimicrobial effects of Qingre compound preparation were coincident on the MIC90 of ESBLs-producing strains and non ESBLs-producing strains.The accumulated antibacterial rates of different concentrations of medicine to Pseudomonas aeruginosa were the highest.The MIC90 values of Qingre compound preparation were 11,11 and 22 g/L for MSSA,MRSA and Streptococcus pneumoniae.The MIC90 of MRSA was coincident with MSSA,but MIC50 of MRSA was slightly higher than that of MSSA.The accumulated antibacterial rates of different concentrations of medicine to MSSA and MRSA were all higher than those of Streptococcus pneumonia.The accumulated antibacterial rate of MSSA wassimilar with that of MRSA.ConclusionThe Chinese medicine Qingre compound preparation could restrain common pathogenic bacteria of URTI except Klebsiella pneumoniae.The antibacterial effect of Qingre compound preparation is significantly better in Ggram-positive bacteria than that of Gram-negative bacteria.

respiratory tract infections;microbial sensitivity tests;Gram-negative bacteria;Gram-positive bacteria; pathogenic bacteria;agar dilution method;qingre compound preparation

R285.5

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.010

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81373849）

1天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科（郵編300150）；2肺病科

馬明坤（1979），女，主管技師，學(xué)士，主要從事臨床免疫及微生物學(xué)檢驗(yàn)研究

△通訊作者E-mail：13662199693@163.com