張蕾，蔡偉娟，張麗翠，張紅梅，潘澤民，程江△

胱硫醚β合成酶基因T833C多態(tài)性與新疆哈、漢民族原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究

張蕾1，蔡偉娟1，張麗翠1，張紅梅1，潘澤民2，程江1△

目的探討血漿同型半胱氨酸（Hcy）及胱硫醚β合成酶（CBS）基因T833C多態(tài)性與新疆哈薩克族（哈族）、漢民族原發(fā)性高血壓（EH）的相關(guān)性。方法選取哈族239例EH患者（哈族EH組）和206例血壓正常者（哈族對照組），漢族256例EH患者（漢族EH組）和224例血壓正常者（漢族對照組）為研究對象，采用全自動生化分析儀檢測4組受試對象血漿中Hcy水平及相關(guān)生化指標(biāo)，采用擴增阻礙突變系統(tǒng)（ARMS）法檢測4組受試者CBS基因T833C多態(tài)性，分析Hcy、CBS基因T833C多態(tài)性與EH的相關(guān)性。結(jié)果新疆哈族、漢族EH患者血漿Hcy水平均顯著高于正常對照組（P＜0.05），哈族EH組C等位基因頻率明顯高于哈族對照組（P＜0.05），且哈族、漢族TT基因型個體血漿Hcy水平顯著低于TC基因型個體（P＜0.05）；漢族EH組及漢族對照組T、C等位基因頻率及TT、TC基因型頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論CBS基因T833C多態(tài)性與新疆哈族EH的發(fā)生存在相關(guān)性，與漢族EH的發(fā)生可能無相關(guān)性，其機制可能與CBS基因突變改變了Hcy的代謝有關(guān)。

高同種半胱氨酸血癥；胱硫醚β合酶；多態(tài)現(xiàn)象,遺傳；高血壓；漢族；哈薩克族

原發(fā)性高血壓（essential hypertension,EH）是由多種病因引起的處于不斷進展?fàn)顟B(tài)的心血管疾病，其致病因素受遺傳與環(huán)境因素影響較大。近些年，大量研究表明高同型半胱氨酸（hyperhomocysteinemia,Hcy）血癥是心腦血管疾病發(fā)生的獨立危險因素[1]。胱硫醚β合成酶（cystathionine β synthase,CBS）是同型半胱氨酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，當(dāng)其存在缺陷時可導(dǎo)致同型半胱氨酸水平升高，進而導(dǎo)致高血壓[2-3]。新疆哈薩克族（哈族）是高血壓的高發(fā)人群，本研究通過檢測血漿Hcy水平及CBS T833C位點基因多態(tài)性，探討其與新疆哈族EH的相關(guān)性，為闡明新疆哈族高血壓遺傳機制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012年9月—2014年5月在新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科住院的哈族、漢族EH患者，同時選取同時期門診健康體檢者為對照組。不同民族2組間年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。高血壓組入選標(biāo)準(zhǔn)符合1999年WHO/ISH高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除繼發(fā)性高血壓、心肌病、糖尿病等患者；對照組入選標(biāo)準(zhǔn)：收縮壓（SBP）＜140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和舒張壓（DBP）＜90 mmHg，未服用降壓藥物，無高血壓家族史，排除肝腎、甲狀腺、糖尿病等疾病。

Tab.1Comparison of baseline characteristics between hypertension group and normotensive表1 不同民族2組間一般資料比較

1.2 血壓測量所有研究對象均經(jīng)靜息15 min后由同一研究人員采用符合計量標(biāo)準(zhǔn)的臺式水銀柱血壓計測量右側(cè)肱動脈血壓，連續(xù)測量3次，每次間隔至少2 min，取平均值。

1.3 體質(zhì)指數(shù)（BMI）計算所有受試者均赤足、免冠、穿單衣測量身高、體質(zhì)量，計算BMI，BMI=體質(zhì)量/身高2（kg/m2）。

1.4 標(biāo)本采集研究對象均空腹12～14 h，抽取肘正中靜脈血6 mL置于EDTA抗凝管中，置-80℃保存，另取靜脈血4 mL置于肝素抗凝管中，1 h內(nèi)2 500 r/min離心10 min，取血清，用于生化指標(biāo)的檢測。

1.5 生化指標(biāo)的測定采用日立7170全自動生化分析儀測定血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白的膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、空腹血糖（FBG）、同型半胱氨酸（Hcy）。

1.6 基因分型

1.6.1 外周DNA提取用AxyPrep血基因組DNA小量制備試劑盒提取白細(xì)胞中的DNA，嚴(yán)格按照試劑盒操作，提取后的DNA保存于-20℃。

1.6.2 引物設(shè)計與合成引物序列參考文獻[4]，由上海生工公司合成。上游引物P1引物序列5′-GGAGAAGTGTCCTGGATGCA-3′；P2引物序列5′-CCCTTCGGGATCCACCCCAA-3′（野生型）；P3引物序列5′-CCCTTCGGGATCCACCCCAG-3′（突變型）。

1.6.3 基因突變檢測方法利用擴增阻礙突變系統(tǒng)（ARMS）法檢測CBS基因T833C位點基因突變。采用PCR擴增CBS基因T833C位點野生型目的片段：擴增體系總體積為25 μL，其中2×PCR Mix 12.5 μL，P1、P2引物各0.5 μL，模板DNA 3 μL，雙蒸水8.5 μL；PCR擴增CBS基因T833C位點突變型目的片段：擴增體系總體積為25 μL，其中2×PCR Mix 12.5 μL，P1、P3引物各0.5 μL，模板DNA 3 μL，雙蒸水8.5 μL；應(yīng)用日本TaKaRa公司全自動PCR擴增儀，野生型、突變型片段擴增條件均為94℃預(yù)變性4 min，然后94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸30 s，循環(huán)35次，72℃延伸10 min。

1.6.4 基因型判斷分別取上述PCR擴增產(chǎn)物10 μL加10×Buffer 2 μL，點樣于1.5%瓊脂糖凝膠中，100 V，電泳30 min后，在紫外燈下檢測照相，經(jīng)美國Bio-rad公司紫外凝膠成像分析系統(tǒng)觀察片段電泳圖，目的片段長度870 bp。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)均用表示，2組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以Hardy-Weinberg平衡法檢測樣本是否有群體代表性；各基因型、等位基因頻率間的比較運用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哈、漢兩民族EH組和對照組一般臨床資料比較哈族EH組SBP、DBP、TC、LDL-C、FBG、Hcy均高于對照組，HDL-C低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；2組BMI、TG差異無統(tǒng)計學(xué)意義。漢族EH組患者SBP、DBP、TC、TG、FBG、Hcy均高于對照組，2組BMI、HDL-C、LDL-C差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2、3。

2.2 CBS T833C基因型的確定CBS T833C基因擴增的目的片段大小為870 bp，其核苷酸多態(tài)性可分為3種類型：野生型（TT型）、純合突變型（CC型）、雜合突變型（TC型）。實際操作中每個個體均加2管，1、2為同一個體，3、4為同一個體，5、6為同一個體，7、8為同一個體。PCR產(chǎn)物直接檢測分型得到2種基因型：野生TT型僅見870 bp 1個條帶；雜合突變TC型可見870 bp 2個條帶；純合子突變型未檢測到，見圖1。

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗對445例新疆哈族、480例新疆漢族人群進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2分別為0.400、1.206，均P＞0.05），漢、哈兩民族在遺傳學(xué)上有較好的群體代表性。

2.4 基因分型結(jié)果比較新疆哈族EH組TT基因型比例低于哈族對照組，TC基因型高于哈族對照組（P＜0.05）；哈族EH組T等位基因頻率低于哈族對照組，C等位基因高于哈族對照組（P＜0.05）。漢族EH組和對照組基因型、等位基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4、5。

Tab.2Comparison of baseline characteristics between Kazak patients with hypertension group and normotensive表2 哈族EH組與對照組一般臨床資料比較

Tab.3Comparison of baseline characteristics between Han patients with hypertension group and normotensive表3 漢族EH組與對照組一般臨床資料比較

Fig.1The appraisal results of CBS T833C gene圖1 CBS T833C基因型鑒定結(jié)果

Tab.4The result of T833C genotypes between Kazak patients with hypertension and normotensive表4 哈族EH組和對照組T833C位點基因分型結(jié)果

Tab.5The result of T833C genotypes between Han patients with hypertension and normotensive表5 漢族EH組和對照組T883C位點基因分型結(jié)果

2.5 CBS T833C不同基因型攜帶者血漿Hcy水平比較哈族TC基因型個體血漿Hcy高于TT基因型個體（P＜0.01）；漢族TC基因型個體血漿Hcy亦高于TT基因型個體（P＜0.01），見表6。

Tab.6The plasma levels of Hcy in differernt genotypes between Han patients and Kazak patients表6 哈族、漢族CBS T833C不同基因型攜帶者血清Hcy比較（μmol/L）

3 討論

Hcy是人體中甲硫氨酸和半胱氨酸代謝過程的中間產(chǎn)物。近些年研究發(fā)現(xiàn)，Hcy水平升高可以造成血管內(nèi)皮損傷,通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加caspase-3的活性誘導(dǎo)祖細(xì)胞的凋亡，致使動脈硬化，血管平滑肌增生[5]，進而導(dǎo)致高血壓的發(fā)生。Nabipour等[6]研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)高血壓患者伴有血漿Hcy水平的升高。Sengwayo等[7]通過對382例參與者的橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，血漿Hcy水平和高血壓有相關(guān)性。而Vaya等[8]發(fā)現(xiàn)高Hcy血癥與高血壓無相關(guān)性。歐洲11個國家共同完成的研究表明，Hcy水平的變化與血壓水平密切相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，哈族、漢族高血壓組患者血漿Hcy水平高于對應(yīng)的對照組（P＜0.01）,提示血漿Hcy水平可能與EH的發(fā)生有一定的聯(lián)系。

CBS作為Hcy代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，其位于第8外顯子287密碼子的T833C位點突變較常見，其編碼的異亮氨取代蘇氨酸后，致使CBS活性下降，導(dǎo)致Hcy活性受阻，造成Hcy在血中蓄積而產(chǎn)生高Hcy血癥。Nienaber等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在南非黑人中CBS基因T833C并沒有顯著影響Hcy的水平；Dutta等[11]對印度280例智力低下患者及健康者的病例對照研究發(fā)現(xiàn)，CBS基因T833C雜合突變基因型血漿Hcy水平低于野生純合型血漿Hcy水平；宋寶強等[12]對570例缺血性腦血管病患者及健康者的病例對照研究發(fā)現(xiàn)，CBS基因T833C不同基因型之間血漿Hcy水平不同。因此CBS基因多態(tài)性具有種族差異，不同種族之間存在明顯的遺傳異質(zhì)性。

新疆哈族群體極少與外界通婚，從地理位置及血緣上為相對隔離人群，有較大遺傳同源性，影響血清高血壓的環(huán)境因素比較一致。目前，對于新疆維族EH的發(fā)病機制尚不明確，是否受遺傳因素的影響，目前鮮有研究報道。本研究結(jié)果顯示，哈族EH組CBS基因T883C位點C等位基因頻率顯著高于哈族對照組（P＜0.01），哈族、漢族TC基因型個體血漿Hcy均高于TT基因型個體（P＜0.01）。而漢族兩組TT、TC基因型和T、C等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這表明CBS基因T883C多態(tài)性位點的等位基因頻率分布與新疆哈族人群EH的發(fā)生有關(guān)，C等位基因可能性新疆哈族EH的危險因素，攜帶C等位基因的哈族個體更易發(fā)生EH,其機制可能是與CBS T833C基因突變，從而改變了Hcy的代謝有關(guān)，而該位點與新疆漢族EH的發(fā)病可能無相關(guān)性。

綜上，CBS基因T833C多態(tài)性與新疆哈族EH的發(fā)生存在相關(guān)性，與漢族EH可能無相關(guān)性。本研究由于課題經(jīng)費有限及病例收集難度大，樣本量較小，各組均未檢測到CC基因型的個體，今后將加大樣本量，并采用多中心、大樣本的研究。

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（2014-06-29收稿2014-09-12修回）

（本文編輯李國琪）

Association between cystathionine β synthase gene T833C polymorphism and essential hypertension in Xinjiang Kazakh population and Han population

ZHANG Lei1，CAI Weijuan1，ZHANG Licui1，ZHANG Hongmei1，PAN Zemin2，CHENG Jiang1△
Division of Clinical Laboratory,The First Affiliated Hospital,College of Medicine,Shihezi University, Xinjiang 832002,China；2 College of Medicine,Shihezi University△

ObjectiveTo investigate the association between plasma homocysteine(Hcy)levels and cystathionine β synthase(CBS)T833C gene polymorphism with essential hypertension in Xinjiang Kazakh and Han populations.Methods A total of 239 Kazak patients with hypertension(Kazak EH group),206 Kazak people with normal blood pressure(Kazak control group),256 Han patients with hypertension(Han EH group)and 206 Han people with normal blood pressure(Han control group)were selected for the study.Amplification refractory mutation system(ARMS)was used to analyze the polymorphism of CBS gene T833C，TT，TC and CC genotypes and the various sites of T，C allele frequencies in four groups.In the meantime,the Hcy level and related biochemical indices were detected using automatic biochemical analyzer.Results The plasma Hcy levels were significantly higher in Kazak EH group and Han EH group than those of Kazak control group and Han control group(P＜0.05).The C allele frequencies were significantly higher in Kazak EH group than that of Kazak control group(P＜0.05).The plasma level of Hcy was significantly lower in Kazakh and Han people with TT genotypes than that of TC genotypes(P＜0.05).There were no significant differences in the frequency of genotypes and alleles between Han EH group and Han control group(P＞0.05).ConclusionThe Cystathionine β synthase gene of T833C polymorphism may be associated with essential hypertension in Kazak people in Xinjiang,but no such association in Han population in Xinjiang.The mechanism may be related to the altered metabolism of Hcy induced by CBS mutation.

hyperhomocysteinemia;cystathionine beta-synthase;polymorphism,genetic;hypertension;Han nationality;Kazakh nationality

R544.11

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.003

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）資助項目（2011AA02A111）

1新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科（832002）；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室

張蕾(1976)，女，副主任技師，主要從事原發(fā)性高血壓發(fā)病機制的研究

△通訊作者E-mail：chengjiang1980@sina.com