陸 樂徐 波張憲亮

（1.上海師范大學體育學院, 上海 200234；2.華東師范大學體育與健康學院,上海 200241）

自主運動對小鼠神經(jīng)干細胞增殖及相關基因表達的影響

陸 樂117徐 波2張憲亮2

（1.上海師范大學體育學院, 上海 200234；2.華東師范大學體育與健康學院,上海 200241）

實驗選用24只5周齡的C57BL/6雄性小鼠，隨機分為運動組12只（R組）和對照組12只（C組），其中R組進行8周自主跑輪運動。第5周開始，隨機從兩組小鼠中各抽取6只，共12只進行連續(xù)1周的BrdU注射。8周運動結(jié)束后，對12只未注射BrdU的小鼠進行斷頸，取雙側(cè)海馬，放入-80℃超低溫冰箱保存，待檢測生化指標。對注射BrdU的12只小鼠進行免疫組化染色預處理，隨后進行BrdU單標免疫熒光染色，從形態(tài)學角度觀察神經(jīng)干細胞增殖情況并計數(shù)。對未注射小鼠進行RT-PCR檢測其NGF、Jagged-1、PS1、Hes1、Hes5、Hes6的 mRNA水平；結(jié)果：8周自主運動后小鼠海馬神經(jīng)干細胞數(shù)量顯著增加（p＜0.01），Notch信號通路中配體Jagged-1、靶基因Hes1的mRNA表達水平顯著升高（p＜0.01）。神經(jīng)生長因子NGF的mRNA表達量顯著升高（p＜0.01）。NGF與配體Jagged-1、靶基因Hes1呈高度相關性（p＜0.01）。結(jié)論：8周自主跑輪運動促進小鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖，可能和Notch信號通路的激活有關。此外，8周運動促使NGF的表達量升高，提示NGF與Notch信號通路可能存在交互作用，可以共同調(diào)節(jié)Notch信號通路下游靶基因的變化，從而影響神經(jīng)干細胞的增殖分化。

神經(jīng)干細胞增殖；Notch信號通路；自主跑輪運動；NGF

生物界和醫(yī)學界長期以來認為，包括大腦在內(nèi)的人類發(fā)育早期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)回路一旦形成，就不會再產(chǎn)生新的功能性神經(jīng)元。伴隨著年齡增長，功能性的神經(jīng)元數(shù)量逐步減少、功能逐漸退化，伴隨產(chǎn)生的類似阿爾茲海默病、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變都是不可逆現(xiàn)象。20世紀60年代，有研究者發(fā)現(xiàn)并正式確認了成年鼠腦內(nèi)存在新生的功能性神經(jīng)元，并且在特定環(huán)境下能夠改變自身的結(jié)構(gòu)和功能，增殖、遷移整合到原本損傷或退化的功能區(qū)域，由此將此類現(xiàn)象命名為“神經(jīng)發(fā)生”[1]。運動作為一類有效的外部刺激手段，能夠調(diào)節(jié)不同的信號通路和相關因子的表達，影響神經(jīng)干細胞的增殖分化，對大腦進行可塑性的調(diào)控，延緩中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元數(shù)量和質(zhì)量的雙重退化。研究顯示，Wnt[2]、Notch等信號通路以及BDNF、NGF等神經(jīng)營養(yǎng)因子均在神經(jīng)干細胞增殖分化過程中起到一定的調(diào)控作用。Notch信號通路是一條高度保守的信號通路，具體功能表現(xiàn)為對細胞命運的決定并影響細胞譜系的發(fā)展，在胚胎發(fā)育早期和成年期，從細胞內(nèi)外信號分子傳到的各個層面影響干細胞的增殖和分化[3]。具體來說，Notch信號通路主要通過“旁側(cè)抑制”作用首先確保新生細胞的增殖數(shù)量，并保證增殖的同質(zhì)細胞順利分化為不同的功能化細胞。而神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)對神經(jīng)干細胞增殖分化有重要的調(diào)控作用，并且最新的研究發(fā)現(xiàn)NGF可能與Notch信號通路產(chǎn)生交互作用[4]，共同調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生過程。因此本研究選用自主跑輪運動作為運動干預模式，探究8周自主運動對小鼠神經(jīng)干細胞增殖情況及Notch信號通路相關因子，并結(jié)合NGF的表達變化，探究自主跑輪運動對神經(jīng)干細胞增殖情況的影響和相關機制。

1 研究對象與方法

1.1 實驗對象與分組

5 周齡的C57BL/6雄性小鼠24只（由上海斯萊克公司提供），體重：(18.18±0.50)克。所有小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠1只，自由飲食飲水。飼養(yǎng)溫度：22±1℃；飼養(yǎng)濕度：40%-60%；自然晝夜節(jié)律變化光照。隨機分為運動組（R組）和對照組（C組），每組12只。

1.2 運動方案

R組小鼠置于裝有自主跑輪的籠中進行8周自主跑輪運動，C組小鼠置于空籠中安靜飼養(yǎng)8周。每天記錄運動量數(shù)據(jù)。

1.3 BrdU注射

第5周開始，隨機從兩組小鼠中各抽取6只，共計12只。進行連續(xù)1周的BrdU腹腔注射，注射量：50mg/kg，注射時間：每日下午體重稱量完成后。

1.4 組織取材

8 周運動結(jié)束后，對12只未注射BrdU的小鼠進行斷頸，取出雙側(cè)海馬，放入-80℃超低溫冰箱保存，待檢測生化指標。對注射BrdU的12只小鼠進行免疫組化染色預處理，預處理步驟參照劉瑾彥[5]等的實驗方法。

1.5 RT-PCR：檢測Jagged-1、PS-1、Hes-1、Hes5、Hes-6、NGF的mRNA表達水平

用Trizol法提取小鼠雙側(cè)海馬內(nèi)總的RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄得到相對穩(wěn)定的cDNA，實時熒光定量PCR檢測小鼠海馬Jagged-1、PS-1、Hes-1、Hes5、Hes-6、NGF的mRNA表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 免疫組織化學熒光染色法：檢測神經(jīng)干細胞增殖

取出注射過BrdU小鼠雙側(cè)海馬組織，用OCT包埋。在恒溫冰凍切片機中進行冰凍、切片。厚度：20μm，室溫靜置12h干燥后放置于-80℃冰箱保存。按照免疫熒光染色步驟進行組織染色，最后用熒光顯微鏡觀察切片，避光拍片。

1.7 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS17.0、GraphPad Prism5圖像處理軟件進行統(tǒng)計學計算與分析，所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差來表示。其中，P ＜0.05表示具有顯著性差異，P ＜0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖情況的影響

如圖1，運動組小鼠海馬新生神經(jīng)干細胞數(shù)量（281.25±55.31）明顯多于對照組小鼠（67.25±12.39），具有極顯著性差異（p＜0.01）。

圖1 兩組小鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖數(shù)量的比較

圖2 小鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖情況

2.2 對小鼠神經(jīng)干細胞增殖相關基因Jagged-1、PS-1、Hes-1、Hes5、Hes-6、NGF的mRNA表達水平的影響

如表2所示，8周自主跑輪運動后，運動組小鼠的Jagged-1、Hes-1和NGF表達量明顯上升，與對照組比較具有極顯著性差異（p＜0.01）。此外，PS1和Hes5的表達也有上升趨勢，但無顯著性差異。

表2 神經(jīng)干細胞增殖相關基因表達

2.3 NGF、Jagged-1、Hes1的相關性分析

如表3所示，NGF與Jagged-1的相關系數(shù)為0.75，具有極顯著性差異（p＜0.01），為高度相關。NGF與Hes1的相關系數(shù)為0.78，具有極顯著性差異（p＜0.01），為高度相關。

表3 NGF、Jagged-1、Hes1的相關性

3 討論

自1965年Altman等人發(fā)現(xiàn)在成年小鼠腦內(nèi)存在新生的神經(jīng)干細胞，并能夠通過增殖、分化、遷移并發(fā)揮功能性作用以來，不斷有研究分別從形態(tài)學、基因水平和蛋白水平等多角度證實了側(cè)腦室的室管膜下層(sub ventricular zone, SVZ)和海馬齒狀回的顆粒細胞下層(sub granular zone, SGZ)為“神經(jīng)發(fā)生”的典型區(qū)域[6]。許多研究通過設置穿梭隧道、迷宮、跑輪等設施創(chuàng)造豐富環(huán)境[7]，觀察到在豐富環(huán)境下，小鼠的神經(jīng)干細胞增殖明顯，成年神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象明顯增強，通Morris水迷宮測試發(fā)現(xiàn)小鼠的學習記憶能力有所提高?！柏S富環(huán)境”是一個較為復雜的概念，包括各類主被動運動、動物社交環(huán)境以及群體效應等。為了區(qū)分不同施加因素對小鼠神經(jīng)干細胞的影響，出現(xiàn)了各類單獨干預因素的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作為積極的刺激手段—運動尤其是自主運動，與豐富環(huán)境組比較，運動組小鼠的神經(jīng)干細胞增殖數(shù)量更多，樹突密度增加，神經(jīng)回路更加緊密，學習記憶能力提高顯著[8]。

為避免被動運動帶來的干擾，本實驗采用自主跑輪運動此類出于自愿的運動模式為外部干預手段。采用BrdU單標記免疫組織化學法，從第5周開始注射BrdU，觀察8周自主跑輪運動后小鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖情況。8周運動結(jié)束后發(fā)現(xiàn)，自主運動組小鼠海馬區(qū)的神經(jīng)干細胞數(shù)量較對照組有極顯著性差異（p＜0.01），約為對照組的4倍。這與已有的研究結(jié)果保持一致，說明海馬是一個極具可塑性的腦區(qū)，合理的運動能夠促進該腦區(qū)的神經(jīng)干細胞增殖，為學習記憶等認知功能的改善創(chuàng)造條件。

自上世紀60年代，研究者發(fā)現(xiàn)成年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)依然具備產(chǎn)生新的功能性神經(jīng)元后，關于其潛在的調(diào)控機制的研究不斷出現(xiàn)。其中，作為高度保守的信號通路，Notch信號通路在神經(jīng)干細胞增殖分化過程中起到關鍵作用，具體功能表現(xiàn)為對細胞命運的決定并影響細胞譜系的發(fā)展，在胚胎發(fā)育早期和成年期，從細胞內(nèi)外信號分子傳到的各個層面影響干細胞的增殖和分化[3]。具體來說，Notch信號通路主要通過“旁側(cè)抑制”作用首先確保新生細胞的增殖數(shù)量，并保證增殖的同質(zhì)細胞順利分化為不同的功能化細胞。Notch信號通路由三部分組成，包括（Notch1-4）受體、配體（Jagged家族的Jagged-1、Jagged-2和Delta-like家族的DLL1、DLL3和DLL4）、下游信號分子組成。Notch受體是一個約300kDa的單次跨膜受體蛋白， 配體為Ⅰ型單次跨膜糖蛋白，通常認為Notch信號通路的激活是通過“三步酶切”實現(xiàn)的[9]。該信號通路的各個環(huán)節(jié)都是影響神經(jīng)干細胞生長發(fā)育的重要環(huán)節(jié)。PS是γ-分泌酶復合物的主要成分，有研究發(fā)現(xiàn)，抑制PS1的活性能夠影響胞內(nèi)信號分子Hes5的表達[10]。同時敲出PS1和PS2后，小鼠在發(fā)育早期就表現(xiàn)出更嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷[11]。Notch信號通路下游的主要調(diào)控因子為堿性螺旋環(huán)螺旋因子（bHLH）家族，可分為抑制性bHLH和促進型bHLH兩類[12]，前者包括Hes1、Hes3、Hes5等，Hes1和Hes5是維持神經(jīng)干細胞保持增殖狀態(tài)的必須因子，用以保證放射狀膠質(zhì)細胞維持增殖狀態(tài)。后者包括Mash1、Math、Ngn等，主要功能為保證神經(jīng)細胞的有效分化和功能發(fā)揮。此外，近年來表達量并不高的Hes6也引起了人們的關注，Hes6在分化以及未分化的細胞中都表所達，并對Hes1有一定的抑制作用。在Notch信號通路的所有配體中，Jagged-1能與多個受體結(jié)合，而Notch信號通路激活的第一步就是受體與配體的結(jié)合，因此可以認為Jagged-1的表達是影響該信號通路激活與否的重要因素。本實驗發(fā)現(xiàn)，8周自主運動后小鼠海馬內(nèi)的Jagged-1mRNA的表達量顯著上升，說明運動能夠促使該信號通路更多的受體與配體結(jié)合。此外，實驗發(fā)現(xiàn)，運動后Notch信號通路下游最重要的靶基因Hes1的基因表達量也顯著提高，而Hes1是啟動細胞增殖的關鍵因子。但運動組與對照組小鼠比較，Hes5和Hes6的mRNA水平?jīng)]有顯著性差異，分析原因可能與該基因在海馬內(nèi)的表達量較低有關，也可推測運動對Hes1的作用更為明顯，表達量較低的Hes6所起到的抑制作用不能體現(xiàn)。

神經(jīng)生長因子（neuron growth factor）NGF是一種分子質(zhì)量為140 kD的跨膜型糖蛋白，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對神經(jīng)元的生長發(fā)育、分化存活以及功能的維持起著至關重要的作用，主要分布在海馬、嗅球、大腦皮層及紋狀體中間神經(jīng)元的膽堿能神經(jīng)元內(nèi)[13]。其中海馬內(nèi)NGF的蛋白表達水平最高。本實驗結(jié)果顯示，運動能夠促使NGF的表達升高，與對照組比較具有極顯著性差異（p＜0.01）。NGF 可以與其高親和力受體TrkA結(jié)合后，激活PI3K/Akt信號通路，活化的Akt可以使得凋亡基因失活，維持神經(jīng)元存活，使得新生的神經(jīng)細胞能夠整合到現(xiàn)有的神經(jīng)網(wǎng)絡回路中，發(fā)揮功能性作用。Patricia 等[4]運用海馬神經(jīng)元培養(yǎng)技術研究發(fā)現(xiàn)：Notch信號通路與NGF可能存在交互作用，NGF可以通過與其低親和力受體P75結(jié)合，通過NF-kB介導引起Notch信號通路下游靶基因Hes1/5表達水平的變化。

基于此，本研究對NGF與Notch信號通路中的關鍵因子Jagged-1和Hes1作了相關性分析，發(fā)現(xiàn)NGF與Jagged-1的相關性系數(shù)為0.75，與Hes1的相關性系數(shù)為0.78，均表現(xiàn)為高度相關，并且運動組小鼠的NGF和Hes1的表達量均顯著升高。由此推測8周自主運動可能通過調(diào)控NGF，并直接作用于Notch下游靶基因Hes1，啟動神經(jīng)干細胞增殖。此外，本實驗結(jié)果顯示，8周運動后PS1的mRNA表達水平?jīng)]有顯著性變化，進一步可以推測，8周自主運動后促使NGF 對Notch信號通路的激活作用更顯著，說明NGF對自主運動的敏感性更強。但PS1在此過程中究竟發(fā)揮什么樣的功能還需要進一步的探究。

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Effects of Voluntary Exercise on Neural Stem Cell Proliferation and Related Genes of Mice

LU Le，etal.
（PE School of Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China）

[Objective and Methods] 24 male mice borned 5 weeks (C57BL/6) are randomly divided into running group (n=12) and control group (n=12), while the running group do voluntary wheel running for 8 weeks. Since the 5th week, 12 mice( each 6 from the two groups) were datelabelled with BrdU for one week, at the. The 12 mice without BrdU datelabelled were killed on the last day after 8 weeks exercise, bilateral hippocampal of them were taken out to be kept in - 80 ℃ cryogenic refrigerator, the mRNA levels of NGF, Jagged-1 mRNA, PS1, Hes1, Hes-5, Hes6 of them were tesetd by RT-PCR method. The 12 mice with BrdU datelabelled were pretreated by immunohistochemical method, then were stained with the method of BrdU single standard immunofluorescence. From the perspective of morphological, neural stem cells proliferation of them were observed and counted. [Results] After 8 weeks of autonomous movement, number of hippocampal neural stem cells increased significantly (p ＜ 0.01) , the ligand Jagged-1 in Notch signaling pathway, mRNA expression level of Hes1 target gene were significantly increased (p ＜ 0.01). the amount of mRNA expression of nerve growth factor NGF significantly increased (p ＜ 0.01).There is highly correlation among model NGF, ligand Jaged-1 and target genes Hes1 (p ＜ 0.01).[Conclusion] 8 weeks voluntary exercise can obviously increase BrdU+labeled neural stem cells in hippocampal region; Voluntary exercise significantly increased Jagged-1 and Hes1gene expression, illustrating that voluntary exercise activate the Notch signaling pathway, which impact the hippocampal neural stem cell proliferation; NGF could directly regulate Notch downstream target genes expressions, which participate in the regulation of neural stem cell proliferation, and affect the ability of learning and memory.

neural stem cell proliferation; Notch signal pathway; voluntary wheel exercise; NGF

陸樂（1987-），上海人，助理實驗師，研究方向：體育運動與身心健康。