張喬會(huì) 王建中 逄錦慧 崔 潔 楊 喆 羅興武

（1.湖北民族學(xué)院科技學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；3.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

杜香（Ledum palustreL.）為杜鵑花科杜香屬的常綠灌木［1］，是中國(guó)東北、內(nèi)蒙古大興安嶺林區(qū)的主要組成樹種，其分布面積約占大興安嶺林地面積的70%［2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)［3］，大興安嶺杜香干葉年產(chǎn)量達(dá)53.6萬t。杜香枝葉成分豐富，含有多種揮發(fā)性精油、熊果酸、多糖等［4，5］。

杜香資源豐富，目前主要研究其精油［6］、熊果酸［7］等，而對(duì)杜香多糖的理化性質(zhì)研究未見報(bào)道。隨著保健品市場(chǎng)的活躍，杜香資源開發(fā)潛力巨大，研究杜香多糖的抗氧化性、穩(wěn)定性、分子剛性等對(duì)于杜香的綜合開發(fā)利用具有重要意義。本研究擬通過水提醇沉法提取杜香多糖［8］，利用紅外分析鑒定多糖基團(tuán)，利用蒽酮硫酸法［9］測(cè)定杜香多糖粗物中多糖的含量，通過總還原力測(cè)定［10－12］和分別清除羥基自由基［13－16］、DPPH自由基［17－19］、超氧陰離子［20－22］能力4種 評(píng)價(jià)方法，分析杜香多糖的抗氧化活性。并采用一般材料分析方法分析杜香多糖的物理性質(zhì)，為其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜香：由內(nèi)蒙古金河林業(yè)局提供，經(jīng)北京林業(yè)大學(xué)植物專家鑒定，自然風(fēng)干后磨粉并過40目篩，放干燥器中備用；

1，1－二 苯 基－2－苦 肼 基 （1，1－dipheny1－2－picrylhydrazyl，DPPH）、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、VC、鐵氰化鉀、三氯乙酸、2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚（BHT）、三氯化鐵、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、氫氧化鈉、鄰菲羅啉：分析純，北京化工廠。

1.2 試驗(yàn)儀器

FT－IR紅外光譜儀：Tensor27型，德國(guó)Bruker公司；

熱重分析儀：TGA60型，日本Shimadzu公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－5203型，上海亞榮生化儀器廠；

電子天平：METTLER TOLEDO型，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；

X射線衍射儀：XRD－6000型，日本Shimadzu公司；

凍干機(jī)：LL1500型，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；

分光光度計(jì)：普析T6型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 杜香多糖的提取 采用水提醇沉法：準(zhǔn)確稱取一定量的杜香枝葉粉，按1∶35（m∶V）加入去離子水，然后放入恒溫水浴震蕩箱中80℃震蕩6h，離心分離液體和固體粉末，向上清液中加入酒精至濃度為85%，置于4℃冰箱中靜置1h，然后分離固液兩相，固體為粗多糖。

1.3.2 杜香多糖純化 將1.3.1得到的樣品按1∶10（m∶V）加入石油醚處理5h進(jìn)行脫脂，接著將脫脂樣品按1∶2（m∶V）溶解于去離子水中，加入酒精至濃度為85%，置于4℃冰箱中靜置1h，分離固液兩相，重復(fù)上述操作4次，然后采用Sevag法［23］脫蛋白，所得樣品在－110℃下冷凍干燥，便可得到杜香多糖成品。將脫脂脫蛋白和脫脂未脫蛋白的多糖樣品配成100μg/mL的溶液，利用紫外光譜分析脫脂、脫蛋白前后杜香多糖的變化。

1.3.3 杜香多糖的紅外分析 取少量樣品置于紅外光譜儀中進(jìn)行測(cè)定，掃描分辨率2cm－1，掃描范圍為400～4 000cm－1，掃描次數(shù)32次［24］。

1.3.4 杜香多糖含量測(cè)定 采用蒽酮硫酸法［23］，并以葡萄糖為參照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 杜香多糖的TG分析 準(zhǔn)確稱取3～8mg的杜香多糖，放入綜合熱重分析儀內(nèi)進(jìn)行熱綜合（TG）分析測(cè)定，以考察杜香多糖的熱穩(wěn)定性。分析條件：掃描溫度20～600℃，升溫速度10℃/min，N2流速40mL/min［24］。

1.3.7 杜香多糖的X－RD分析 取一定量的杜香多糖于X射線衍射儀的樣品室內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描范圍為5°～60°，在掃描范圍內(nèi)以5°/min的變化速率進(jìn)行X射線照射，利用得到的數(shù)據(jù)繪制XRD衍射強(qiáng)度曲線圖，并計(jì)算出樣品的結(jié)晶度。根據(jù)衍射角與衍射強(qiáng)度的關(guān)系繪制XRD曲線。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Excel（Office 2007）軟件整理數(shù)據(jù)，Orgin軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜香多糖純化結(jié)果分析

由圖1可知：未脫蛋白前，杜香多糖溶液在280nm處有明顯的吸收峰，說明其含有蛋白成分。脫蛋白后的樣品在280nm處沒有明顯的吸收峰，說明其不含蛋白。與未脫蛋白的樣品進(jìn)行比較，同一波長(zhǎng)下，脫蛋白樣品的吸收值偏低，這可能是因?yàn)槲疵摰鞍椎亩嗵菢悠分泻幸欢ǖ暮怂峒暗鞍?，這兩種物質(zhì)含有一定數(shù)量的堿基和疏水基團(tuán)，從而使樣品的紫外吸收產(chǎn)生增色效應(yīng)。脫蛋白后，蛋白、核酸被除去，產(chǎn)生增色效應(yīng)的基團(tuán)也被除去，樣品紫外吸收恢復(fù)正常，因而在同一波長(zhǎng)下，脫蛋白的多糖樣品比未脫蛋白的多糖樣品紫外吸收值要略低。

圖1 杜香多糖樣品紫外掃描光譜Figure 1 UV scanning spectrum of polysaccharide fromLedum palustre L.

2.2 杜香多糖紅外分析

由圖2可知，譜圖在3 389cm－1和1 156～1 024cm－1的峰分別為O—H和C—O的伸縮振動(dòng)，1 024cm－1的較強(qiáng)吸收也說明了杜香多糖中可能有葡萄糖結(jié)構(gòu)，2 889cm－1的尖峰以及1 567～1 370cm－1的峰分別為C—H的伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)，1 648cm－1處出現(xiàn)吸收峰，推測(cè)該峰為醛基中CO的伸縮振動(dòng)引起的，譜圖在1 648cm－1波數(shù)處還出現(xiàn)一較強(qiáng)的吸收峰，說明杜香多糖中可能有酰氨取代基，譜圖在903cm－1波數(shù)處還出現(xiàn)吸收峰，說明杜香多糖可能含有β－型糖苷鍵?？傊?，杜香水提醇沉物具有多糖的一般吸收峰，證明杜香水提醇沉物為杜香多糖。

圖2 杜香多糖的紅外光譜圖Figure 2 IR spectrum of polysaccharide fromLedum palustre L.

2.3 杜香多糖含量的測(cè)定結(jié)果

由圖3可知：在含量為0.00～0.05mg/mL的范圍內(nèi)，葡萄糖含量與吸光度線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝9.79x－0.002，回歸系數(shù)R2＝0.995。測(cè)得杜香粗提物的吸光值為0.272，從而計(jì)算出杜香多糖粗提物中多糖的含量為69.95%。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 Standard curve of glucose

2.4 杜香多糖抗氧化結(jié)果分析

2.4.1 清除DPPH·的能力 由圖4可知：抗氧化劑（Vc，BHT等）明顯比杜香多糖的清除能力強(qiáng)，這是因?yàn)榭寡趸瘎┎捎玫氖羌兤?，單位體積內(nèi)濃度相對(duì)較高，而制備的杜香多糖粗提物純度相對(duì)較低所致。隨濃度升高，杜香多糖對(duì)DPPH·的清除率呈明顯上升趨勢(shì)，在0.60mg/mL處，達(dá)到54.70%。利用線性關(guān)系得出杜香多糖清除DPPH·的EC50值為0.52mg/mL。

圖4 杜香多糖與Vc、BHT清除DPPH·能力的比較Figure 4 The scavenging rate of DPPH radical on polysaccharide from Ledum palustre L.compared with Vc，BHT

2.4.2 清除·OH的能力 由圖5可知：隨濃度升高，杜香多糖和VC對(duì)·OH的清除率呈遞增趨勢(shì)；VC對(duì)·OH的清除效果明顯優(yōu)于杜香多糖。當(dāng)濃度為1.00mg/mL時(shí)，杜香多糖的清除率為40.97%。利用線性關(guān)系得出杜香多糖對(duì)·OH的EC50值為1.41mg/mL。

圖5 杜香多糖與Vc清除·OH能力的比較Figure 5 The scavenging rate of hydroxyl radical on polysaccharide from Ledum palustre L.compared with Vc

圖6 杜香多糖與BHT清除·能力的比較Figure 6 The scavenging rate of superoxide anion radical on polysaccharide fromLedum palustre L.compared with BHT

2.4.4 總還原力 還原能力的測(cè)定是以樣品是否為有效的電子供應(yīng)者為評(píng)價(jià)指標(biāo)的。若是有效的電子供應(yīng)者，其供應(yīng)的電子可將Fe3＋還原成Fe2＋，還可與自由基形成較惰性物質(zhì)，從而中斷自由基連鎖反應(yīng)。一般情況下，物質(zhì)的吸光度越大，還原能力越強(qiáng)，其抗氧化能力也越高［25］。由圖7可知：隨濃度增加，吸光度值增加趨勢(shì)比較平緩，相同濃度時(shí)抗氧化劑BHT的總還原能力明顯優(yōu)于杜香多糖。杜香多糖的還原力隨濃度的增加呈線性增加，杜香多糖的還原力在0.95～1.00mg/mL范圍內(nèi)高于0.095～0.100mg/mL的BHT的溶液，還原力較強(qiáng)。

2.5 杜香多糖物理性質(zhì)分析結(jié)果

圖7 杜香多糖與Vc、BHT還原力的比較Figure 7 The reducing power of polysaccharide fromLedum palustre L.compared with Vc，BHT

圖8 杜香多糖失重圖（氮?dú)獗Ｗo(hù)）Figure 8 TGA analysis of polysaccharide fromLedum palustre L.under N2condition

2.5.1 熱重分析 由圖8可知，杜香多糖具有2次明顯的失重過程，這與多糖的含水量、組成和聚集態(tài)等有關(guān)。第1次失重出現(xiàn)在78℃左右，失重率為1.50%，可能是多糖受熱失水形成的失重峰；第2次失重出現(xiàn)在190～550℃，失重率為41.97%，此溫度區(qū)間的失重快，說明杜香多糖在該溫度范圍內(nèi)發(fā)生了劇烈的分解反應(yīng)，也說明在190℃以內(nèi)時(shí)，杜香多糖是相對(duì)穩(wěn)定地發(fā)生熱裂解。550℃以后的溫度范圍，杜香多糖失重率為13.80%，說明在這個(gè)范圍內(nèi)，杜香多糖進(jìn)一步降解。

2.5.2 X射線衍射分析 由圖9可知，杜香多糖的X射線衍射強(qiáng)度曲線最高峰出現(xiàn)在2θ為20°附近，且峰形圓頓，基本呈現(xiàn)典型饅頭峰的特性，說明結(jié)晶度較低。2θ為30°和40°時(shí)，有2個(gè)圓頓的小肩峰，也說明了其結(jié)晶度低。這可能是因?yàn)槎畔愣嗵鞘怯蓭追N多糖混合而成的一種混合性多糖，不同成分的衍射強(qiáng)度曲線的最高峰出現(xiàn)的2θ位置不同，從而產(chǎn)生了肩峰現(xiàn)象?？傮w來說，杜香多糖的結(jié)晶度低（3.6%），分子剛性較差。這也可以作為鑒定杜香多糖的一種方式。

圖9 杜香多糖的X－衍射強(qiáng)度曲線圖Figure 9 XRD intensity curves of polysaccharide fromLedum palustre L.

3 結(jié)論

杜香多糖具有一定的抗氧化活性，并與濃度呈一定的函數(shù)關(guān)系，且在一定范圍內(nèi)隨濃度增高，其活性逐漸增強(qiáng)。杜香多糖清除DPPH·、·、·OH的EC50值分別為0.52，1.41，1.71mg/mL，還原力接近 BHT并與濃度呈正相關(guān)。杜香多糖結(jié)晶度低，分子剛性差，其在190℃溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定，超過該溫度，將發(fā)生劇烈的熱分解使其失重。本試驗(yàn)研究了杜香多糖的理化性質(zhì)，可為其開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。但關(guān)于杜香多糖的純化、單糖分析及結(jié)構(gòu)鑒定仍需進(jìn)一步的研究。

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