康傳紅，田亞新，李秀涼，董義杰，原繼紅，王運來，韓曉云,*

（1.黑龍江大學(xué)化學(xué)化工與材料學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080）

Pseudomonas sp. W7產(chǎn)低溫蛋白酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

康傳紅1，田亞新2，李秀涼2，董義杰2，原繼紅1，王運來2，韓曉云2,*

（1.黑龍江大學(xué)化學(xué)化工與材料學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080）

采用Plackett-Burman法對影響假單胞菌（Pseudomonas sp.）W7產(chǎn)低溫蛋白酶的因素進(jìn)行顯著性分析，篩選出對產(chǎn)酶影響顯著的3 個因素：葡萄糖、蛋白胨和MgSO4；然后用最陡爬坡試驗逼近最大產(chǎn)酶區(qū)域；應(yīng)用Box-Behnken原理設(shè)計和響應(yīng)面分析確定產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最佳組合為：葡萄糖4.25 g/L、蛋白胨7.00 g/L、干酪素4.00 g/L、K2HPO45.00 g/L、KH2PO41.00 g/L、CaCl20.26 g/L、MgSO40.14 g/L，低溫蛋白酶的酶活力達(dá)到了183.9 U/mL，比優(yōu)化前提高了21%。另外，對Pseudomonas sp. W7的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，在單因素的基礎(chǔ)上，利用正交試驗設(shè)計，最終確定產(chǎn)酶的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為20 ℃、初始pH值為7.0、接種量為3%、裝液量為20%、搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min，在最佳條件時測得的酶活力為193.2 U/mL。通過生長曲線和產(chǎn)酶曲線的測定，確定產(chǎn)酶的培養(yǎng)時間為48 h。

低溫蛋白酶；假單胞菌W7；培養(yǎng)條件優(yōu)化；響應(yīng)面分析

低溫微生物及其所產(chǎn)的極端酶類已成為國際研究的一個熱門領(lǐng)域[1-2]。低溫蛋白酶是低溫微生物分泌的催化肽鍵水解的一類酶，它的最適溫度一般在40 ℃以下，在低溫條件甚至0 ℃時都有一定的催化效率[3]。低溫蛋白酶大都是由低溫環(huán)境中的微生物在低溫脅迫的情況下為了適應(yīng)極端環(huán)境而產(chǎn)生的，例如兩極地區(qū)、冰窟、高山、深海和凍土等天然的低溫環(huán)境以及冰箱、冷庫等人為低溫環(huán)境中的微生物[4-5]。此外，也可從低溫植物和冷血動物上分離到[6]。目前，研究比較深入的低溫蛋白酶大多數(shù)是從低溫微生物和適冷魚類體內(nèi)分離出來的，其中低溫微生物主要包括：真菌、細(xì)菌和酵母等。產(chǎn)低溫蛋白酶的細(xì)菌主要屬于Pseudomonas屬、Xanthomonas屬、Aeromonas屬和Colwellia屬等[7-8]。近年來，隨著全基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用以及各種低溫酶晶體結(jié)構(gòu)[9]的獲得，為進(jìn)一步探究極端環(huán)境微生物適應(yīng)機制和低溫酶的分子結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)[10]。低溫微生物在溫度比較低的環(huán)境中長期進(jìn)化適應(yīng)，擁有了能夠在低溫條件下生存繁殖的結(jié)構(gòu)特征和生理生化機制，相應(yīng)地，由其產(chǎn)生的低溫蛋白酶也具有特殊的結(jié)構(gòu)和生理特性[11]，在食品[12-13]、化妝品[14-15]、洗滌[16-18]、污水處理等工業(yè)上有著中溫蛋白酶無法比擬的優(yōu)越性，在很多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用潛力。

培養(yǎng)基的組成對低溫菌分泌蛋白酶影響比較明顯，尤其是碳源、氮源，研究快速利用碳源的阻遏作用和適合長度多肽的誘導(dǎo)作用最為重要[19-20]。本研究是在前期單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基，并利用SAS軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而確定產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最佳組成。另外，本研究在確定最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計從培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的初始pH值、接種量及裝液量等幾個方面對產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期獲得最佳培養(yǎng)條件，為后續(xù)科學(xué)研究和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

假單胞菌（Pseudomonas sp.）W7，由黑龍江大學(xué)生物工程專業(yè)實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖5 g、蛋白胨10 g、酵母膏2 g、K2HPO45 g、KH2PO42 g、MgSO40.1 g、CaCl20.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2，115 ℃高壓滅菌30 min。

1.1.3 試劑

牛肉膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；干酪素 鄭州皇朝化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1810紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；MLS-3020滅菌鍋 日本三洋公司；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；低溫高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活力的測定

蛋白酶活性采用Folin-酚法測定[21]。用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）配制的2 g/100 mL酪蛋白為底物。用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）將酶液稀釋合適的倍數(shù)。取1 mL稀釋的酶液，在35 ℃條件下保溫1 min，加入同樣溫度的底物1 mL，在35 ℃條件下反應(yīng)10 min后，加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng)。在35 ℃保溫20 min后，12 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液加入5 mL 0.4 mol/L的碳酸鈉，混勻后加入1 mL的福林試劑，混勻后在35 ℃保溫20 min，然后用分光光度計測定660 nm波長處的光密度（OD）值。以滅活的酶樣品為對照。標(biāo)準(zhǔn)曲線用不同濃度的酪氨酸來制定。酶活力單位（U）定義為在35 ℃條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1 個蛋白酶活力單位。

1.3.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

以下培養(yǎng)基優(yōu)化試驗中，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度20 ℃、接種量2%、裝液量28%、搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。

1.3.2.1 Plackett-Burman試驗[22]確定主要影響因素

對培養(yǎng)基每種成分選高低2個水平，其中高水平是低水平的1.5倍，以酶活力作為響應(yīng)值，從中篩選出對產(chǎn)酶影響顯著的培養(yǎng)基組分。試驗設(shè)計的因素及水平如表1所示，每組試驗有3個重復(fù)，取3組試驗的平均值。分別計算各因素效應(yīng)，并進(jìn)行重要性評價。

表1 Plackett-Burman試驗因素及水平設(shè)計Table 1 Factors and levels used in Plackett-Burman design

1.3.2.2 最陡爬坡法確定主要影響因素的水平

最陡爬坡法[23]以試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據(jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化的步長，以酶活力為響應(yīng)值，從而找出各因素最大響應(yīng)區(qū)域。

1.3.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基最佳配比

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，采用三因素三水平的三元二次響應(yīng)面分析方法[24]，優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基。根據(jù)最陡爬坡試驗的結(jié)果，自變量的試驗水平分別以－1、0、1進(jìn)行編碼，共設(shè)計15 個試驗點，其中1～12為析因點；自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點；13～15是零點，為區(qū)域的中心點，中心試驗重復(fù)3 次來估計試驗誤差。

1.3.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

以下產(chǎn)酶條件優(yōu)化使用的培養(yǎng)基為優(yōu)化好的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，除考察的特定條件變化外，其他培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)培養(yǎng)基pH 7.2、培養(yǎng)溫度20 ℃、接種量2%、裝液量28%、搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。

1.3.3.1 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

將Pseudomonas sp. W7接種到優(yōu)化好的產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，分別在10、15、20、25、30 ℃培養(yǎng)48 h，測定酶活力，確定最佳培養(yǎng)溫度。

1.3.3.2 培養(yǎng)基初始pH值的優(yōu)化

將培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0這6 個梯度，培養(yǎng)48 h，測定酶活力，從而確定Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始pH值。

1.3.3.3 接種量的優(yōu)化

將Pseudomonas sp. W7分別按0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的接種量，接種到優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h，測定酶活力，從而確定最佳接種量。

1.3.3.4 裝液量的優(yōu)化

采用250 mL的三角瓶，固定轉(zhuǎn)速，通過改變裝液量來確定最佳溶解氧。試驗設(shè)置裝液量分別為12%、20%、28%、40%，搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48 h，測定酶活力，從而確定最佳裝液量。

1.3.3.5 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

將接種后的培養(yǎng)基分別在80、100、120、140、160 r/min培養(yǎng)48 h，測定酶活力，確定最佳搖床轉(zhuǎn)速。

1.3.3.6 Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件正交試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果選擇培養(yǎng)基的初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量和裝液量4 個因素，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗設(shè)計，確定最佳培養(yǎng)條件。根據(jù)在最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基基礎(chǔ)上優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件，進(jìn)行實驗驗證。

將Pseudomonas sp. W7在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，然后每隔2 h取樣，在418 nm波長處測定菌體的OD值，并測定培養(yǎng)不同培養(yǎng)時間的酶活力，從而確定最佳產(chǎn)酶時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果與分析

2.1.1 Plackett-Burman試驗及其結(jié)果分析

Plackett-Burman試驗設(shè)計方案及結(jié)果如表2所示。分別計算各因素效應(yīng)，并進(jìn)行重要性評價。利用SAS軟件對Plackett-Burman試驗設(shè)計的結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸模型方差分析（表3）和各因素的主效應(yīng)（表4）。從中可以發(fā)現(xiàn)可信度大于95%的幾個因素均為培養(yǎng)基組分。它們對產(chǎn)酶影響順序為：葡萄糖質(zhì)量濃度＞蛋白胨質(zhì)量濃度＞MgSO4質(zhì)量濃度。本試驗所得的擬合回歸方程達(dá)到顯著性（模型的P=0.035 15＜0.05），R2=99.98%，表明本試驗99.98%的數(shù)據(jù)變異可以用此回歸方程來解釋。所得回歸方程為：Y=163.050 0+5.4000A+3.316 7B+ 0.683 3C+0.350 0D+1.183 3E+1.183 3F+ 1.033 3G－3.366 7H－1.966 7I+2.616 7J。因此，對葡萄糖、蛋白胨和MgSO4質(zhì)量濃度3 個培養(yǎng)基組分進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化組合。

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 2 Plackett-Burman design with experimental and predicted values of protease activity

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model from Plackett-Burman design

表4 各因素的主效應(yīng)Table 4 Major effect of each factor

2.1.2 最陡爬坡試驗結(jié)果

從各因素的主效應(yīng)表中可以看出在影響酶活力的各主要因素中，葡萄糖、蛋白胨和MgSO4質(zhì)量濃度都呈顯著正效應(yīng)。根據(jù)這3 個因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向和步長，其他各因素分別取各自的水平進(jìn)行試驗。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Steepest ascent design with experimental values of protease activity

由表5可知，隨著葡萄糖、蛋白胨和MgSO4的質(zhì)量濃度3 個主要影響因素的不同變化，酶活力的變化趨勢是先升后降，其中第3組培養(yǎng)基對應(yīng)的酶活力達(dá)到了最大值，達(dá)到176.5 U/mL，相應(yīng)變量接近最大響應(yīng)區(qū)域，所以選取第3組條件即葡萄糖4.0 g/L、蛋白胨7.0 g/L和MgSO40.14 g/L為中心點進(jìn)行響應(yīng)面的分析。

2.1.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

通過規(guī)范崗位大練兵工作，能夠從根本上規(guī)范隊員訓(xùn)練行為，消防訓(xùn)練安全隱患，更為隊員實戰(zhàn)滅火提供扎實的業(yè)務(wù)技能基礎(chǔ)，對保障隊員滅火安全、提升隊員救援能力起到了積極的推進(jìn)作用。下一步，治安保衛(wèi)處將結(jié)合公司應(yīng)急救援隊伍建設(shè)要求，完善崗位標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)流程大練兵內(nèi)容，為提升集團公司應(yīng)急救援能力不斷前行。

根據(jù)最陡爬坡試驗的結(jié)果，設(shè)計Box-Behnken試驗的因素與水平，設(shè)計方案及結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Box-Behnken design with experimental and predicted values of protease activity

通過SAS的響應(yīng)面回歸過程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型，并進(jìn)而尋求最優(yōu)響應(yīng)因子水平?；貧w方程中回歸系數(shù)的估算值見表7，得到擬合二次回歸方程：Y=－1 955.600 0+314.283 3A+286.608 3B+ 6 624.792 0C－36.266 7A2+0.900 0AB－112.500 0AC－20.366 7B2－30.000 0BC－20 979.170 0C2。

表7 回歸方程中回歸系數(shù)的估計Table 7 Estimated coeffi cients of regression equation from Box-Behnken design

表8 模型方程方差分析Table 8 Analysis of variance of model equation from Box-Behnken design

表7、8的數(shù)據(jù)分析表明二次響應(yīng)面回歸模型顯著（決定系數(shù)R2=0.974 2），模型擬合程度很好，說明這3 個因素及其二次項能解釋酶活力變化的97.42%；模型回歸P=0.001 9；擬合不足P=0.620 4，說明模型失擬不顯著，方程回歸顯著，所以該模型可以用于產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化的理論預(yù)測?；貧w方程中線性項和二次項也是顯著的（P值分別為0.001 5和0.799 0），交叉項不顯著，說明響應(yīng)面分析的3 個因素之間的交互效應(yīng)較小。任意兩個因素與酶活力之間的關(guān)系可通過三維與二維圖形立體直觀地表現(xiàn)出來（圖1～3）。

在獲得回歸非線性模型和響應(yīng)面之后，對已回歸的非線性模型方程求一階偏導(dǎo)，并令其等于零得到三元一次方程組，可以得到曲面的最大點，求解此方程組得到最大產(chǎn)酶水平的最佳培養(yǎng)基組分質(zhì)量濃度，即葡萄糖4.25 g/L、蛋白胨7.00 g/L、MgSO40.14 g/L，酶活力預(yù)測值為180.2 U/mL，也即產(chǎn)酶水平最高時培養(yǎng)基最優(yōu)組成：葡萄糖4.25 g/L、蛋白胨7.00 g/L、干酪素4.00 g/L、K2HPO45.00 g/L、KH2PO41.00 g/L、CaCl20.26 g/L、MgSO40.14 g/L。

以該法選出的最適培養(yǎng)基組分質(zhì)量濃度進(jìn)行發(fā)酵實驗，發(fā)酵產(chǎn)酶水平達(dá)到183.9 U/mL，實驗值與模型計算值相差2.05%，可見該模型可以較好地預(yù)測實際發(fā)酵情況。證明了響應(yīng)面分析法優(yōu)化Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基是可行有效的。經(jīng)優(yōu)化后Pseudomonas sp. W7產(chǎn)低溫蛋白酶的能力由151.8 U/mL提高到183.9 U/mL，提高了21%。

圖1 培養(yǎng)基中葡萄糖和蛋白胨質(zhì)量濃度對蛋白酶活力影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.1 Response surface and its corresponding contour plots for the effects of glucose and peptone concentration on the production of the protease

圖2 培養(yǎng)基中葡萄糖和MgSO4質(zhì)量濃度對蛋白酶活力影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.2 Response surface and its corresponding contour plots for the effects of glucose and MgSO4concentration on the production of the protease

圖3 培養(yǎng)基中MgSO4和蛋白胨質(zhì)量濃度對蛋白酶活力影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.3 Response surface and its corresponding contour plots for the effects of MgSO4and peptone concentration on the production of the protease

2.2 產(chǎn)酶條件優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

圖4 培養(yǎng)溫度對Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of culture temperature on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

如圖4所示，從10 ℃開始隨著培養(yǎng)溫度的升高酶活力逐漸增大，在20 ℃時酶活力達(dá)到最大值，而后隨著培養(yǎng)溫度的升高，酶活力逐漸下降，到30 ℃時，酶活力僅為最大酶活力的15%?？梢娕囵B(yǎng)溫度對Pseudomonas sp. W7的分泌蛋白酶的影響比較顯著。低溫能夠誘導(dǎo)能夠提高酶的表達(dá)量，而且溫度有時也影響耐冷菌分泌低溫蛋白酶的種類[25]。因此，Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)溫度為20 ℃。

2.2.2 培養(yǎng)基初始pH值對Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響

試驗分別控制發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值在5～10之間進(jìn)行培養(yǎng)，在不同pH值條件下所測得的酶活力表明：pH值對微生物的生長代謝有重要影響，當(dāng)處于最適pH值時，菌體的產(chǎn)酶速率最快，故其酶活力也最大。由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值在7.0時，酶活力可達(dá)最大，所以Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的最佳pH值為7.0。

圖5 培養(yǎng)基的初始pHH 值對Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of initial medium pH on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

2.2.3 接種量對Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響

分別以0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的不同接種量作對比進(jìn)行試驗，結(jié)果見圖6，當(dāng)接種量為2%時，酶活力可達(dá)到最大值，所以最適接種量為2%。

圖6 接種量對Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of inoculum amount on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

2.2.4 裝液量對Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響

試驗設(shè)計裝液量分別為12%、20%、28%、40%，搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖7所示，當(dāng)250 mL三角瓶的裝液量為50 mL時，測得的酶活力最高，所以最適裝液量為20%。

圖7 裝液量對Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of medium loading volume on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

2.2.5 搖床轉(zhuǎn)速對Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響

圖8 搖床轉(zhuǎn)速對Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of rotation speed on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

采用250mL的三角瓶，在其他培養(yǎng)條件一定的情況下，改變搖床轉(zhuǎn)速來檢測搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖8所示，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min時產(chǎn)酶達(dá)到最大值，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大，產(chǎn)酶沒有明顯的變化，搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響不大。因此，確定最佳的搖床轉(zhuǎn)速為100r/min。

2.2.6 產(chǎn)酶條件正交試驗優(yōu)化結(jié)果

通過對Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的單因素試驗結(jié)果，選取對酶活力影響較大的4 個因素，即培養(yǎng)基的初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量和裝液量進(jìn)行四因素三水平正交試驗。

表9 產(chǎn)酶條件的正交試驗設(shè)計及分析Table 9 Orthogonal array design with experimental values of protease activity

表10 產(chǎn)酶條件的正交試驗結(jié)果方差分析Table 10 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array design

由表10可知，從方差分析結(jié)果（F比）可以看出，培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶的影響的顯著性次序為：培養(yǎng)基的初始pH值＞培養(yǎng)溫度＞接種量＞裝液量。根據(jù)正交試驗結(jié)果（表9）中k值表明：Pseudomonas sp. W7產(chǎn)低溫蛋白酶最佳的條件為培養(yǎng)基的初始pH7.0、培養(yǎng)溫度20℃、接種量3%、裝液量20%。根據(jù)上述優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行實驗驗證，實際測得的酶活力為193.2 U/mL。

2.2.7 Pseudomonas sp. W7的生長曲線和產(chǎn)酶曲線

圖9 Pseudomonasmonas sp. W7的生長曲線與產(chǎn)酶曲線Fig.9 Growth and protease production curves of Pseudomonas sp. W7

在最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件下測定并繪制了Pseudomonas sp. W7的生長曲線和產(chǎn)酶曲線。由圖9可知，Pseudomonas sp. W7在6 h左右進(jìn)入對數(shù)期，22 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。低溫蛋白酶的產(chǎn)生與菌體生長呈現(xiàn)正相關(guān)。菌體生長進(jìn)入對數(shù)期后即分泌低溫蛋白酶，酶活力不斷上升，在48 h時達(dá)到最高，后略有波動。

3 結(jié) 論

采用響應(yīng)面優(yōu)化法快速篩選影響Pseudomonas sp. W7菌株產(chǎn)低溫蛋白酶培養(yǎng)基中的顯著因素，并通過建立多項數(shù)學(xué)模型，采用統(tǒng)計分析對模型進(jìn)行顯著性檢驗來優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最佳組成。優(yōu)化得到的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：葡萄糖4.25 g/L、蛋白胨7.00 g/L、干酪素4.00 g/L、K2HPO45.00 g/L、KH2PO41.00 g/L、CaCl20.26 g/L、MgSO40.14 g/L。優(yōu)化后，Pseudomonas sp. W7的產(chǎn)酶能力達(dá)到183.9 U/mL，比優(yōu)化前提高了21%。在單因素的基礎(chǔ)上利用正交試驗設(shè)計對產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為20 ℃、培養(yǎng)基的初始pH值為7.0、接種量為3%、裝液量為20%、搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min。在最佳條件時測得的酶活力為193.2 U/mL。通過生長曲線和產(chǎn)酶曲線的測定，確定產(chǎn)酶的培養(yǎng)時間為48 h。

對低溫酶的研究無論在基礎(chǔ)資源發(fā)掘方面，還是在產(chǎn)業(yè)應(yīng)用方面都具有重要意義。本研究對Pseudomonas sp. W7產(chǎn)低溫蛋白酶培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，為Pseudomonas sp. W7進(jìn)一步的工業(yè)化生產(chǎn)、耐冷菌以及低溫蛋白酶的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of Medium Components and Culture Conditions for Cold-Adapted Protease Produced by Pseudomonas sp. W7

KANG Chuanhong1, TIAN Yaxin2, LI Xiuliang2, DONG Yijie2, YUAN Jihong1, WANG Yunlai2, HAN Xiaoyun2,*
(1. School of Chemistry and Material Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080, China; 2. School of Life Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080, China)

Cold-adapted proteases have great superiority in the food, cosmetic, pharmaceutical and detergent industries due to high catalytic activity at low temperature and thermal instability. In the present study, the Plackett-Burman design was used to identify glucose, peptone and MgSO4as the most signifi cant medium components affecting the production of cold-adapted protease by Pseudomonas sp. W7. Then the steepest ascent experiment was used to approach the optimal region of the three medium components. Box-Behnken design and response surface analysis were used to determine the best culture medium containing 4.25 g/L glucose, 7.00 g/L peptone, 4.00 g/L casein, 5.00 g/L K2HPO4, 1.00 g/L KH2PO4, 0.26 g/L CaCl2and 0.14 g/L MgSO4. After the optimization, the yield of the protease was increased by 21% to 183.9 U/mL. In addition, the optimal culture conditions for producing cold-adapted protease using the optimized medium were determined using combination of single factor experiments and orthogonal array design experiments as culture temperature of 20 ℃, initial medium pH of 7.0, inoculum amount of 3%, medium loading volume of 20% and rotation speed of 100 r/min. Under these conditions, the enzyme activity w as 193.2 U/mL. Based on the growth curve and enzyme production curve, the optimal culture period was determined to be 48 h.

cold-adapted protease; Pseudomonas sp. W7; optimization of fermentation conditions; response surface analysis

Q814.9

A

1002-6630（2015）19-0163-07

10.7506/spkx1002-6630-201519029

2014-10-29

黑龍江省自然科學(xué)基金項目（C201035）

康傳紅（1966-），女，教授，博士，研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：kangchh@163.com

*通信作者：韓曉云（1970-），女，副教授，博士，研究方向為生物工程。E-mail：zbjnefu@126.com