宋濤平 邱華麗 王淑娟 彭新凱 楊麗霞（長沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，湖南 長沙 410013）

近期中國衛(wèi)計(jì)委通報(bào)了2014年全國食物中毒事件情況，突發(fā)公共衛(wèi)生事件網(wǎng)絡(luò)直報(bào)系統(tǒng)全年共收到26個(gè)省份（含自治區(qū)、直轄市）食物中毒類突發(fā)公共衛(wèi)生事件報(bào)告160起，中毒人數(shù)5 657人，其中死亡人數(shù)110人；而微生物性食物中毒人數(shù)最多，占中毒人數(shù)67.7%；且微生物性食物中毒事件主要由沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等引起［1］。在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒事件也占到整個(gè)細(xì)菌性食物中毒事件的33%；加拿大更高達(dá)45%［2］。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是革蘭氏陽性菌，為全球最常見的食源性致病菌之一，其引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中占有較大比例［3］。人類因食用受其污染的肉、奶、魚、蛋類及其制品等食品而感染，主要會引起食物中毒及肺炎、心包炎、敗血癥等疾病［4－6］。金黃色葡萄球菌可在溫度7.0～48.5℃、pH 4.2～9.3及高鹽（高達(dá)15%NaCl）的環(huán)境條件下生存，這些特點(diǎn)皆有利于其污染不同的食品［7］。因此，建立快速、靈敏、可靠的食源性致病菌金黃色葡萄球菌的檢測方法，對預(yù)防和控制致病菌引起的中毒事件發(fā)生，增強(qiáng)食品安全性具有重要意義。

傳統(tǒng)致病菌檢測以生化培養(yǎng)檢測方法為主，檢測時(shí)間較長，且靈敏度較低。PCR技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)，常被用于致病菌檢測，但需要后續(xù)電泳檢測，增加了污染的風(fēng)險(xiǎn)［8，9］。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)也可用于致病菌檢測［10－12］，但其設(shè)備、試劑昂貴，且需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的人員操作，對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件的要求也較高，只有專業(yè)實(shí)驗(yàn)室才能具備上述條件，基層單位難以開展此類檢測。

環(huán) 介 導(dǎo) 等 溫 擴(kuò) 增 （loop－mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是利用BstDNA聚合酶在60～65℃恒溫條件下完成核酸的擴(kuò)增［13］。BstDNA聚合酶在較高鎂離子濃度條件下，才具有5＇→3＇外切酶活性［14］。該酶80℃處理15min即可失活。在LAMP反應(yīng)中，需要針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，在恒溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增［13］。環(huán)引物的加入可縮短反應(yīng)時(shí)間［15］。LAMP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于致病菌的檢測，包括金黃色葡萄球菌［16］、大腸桿菌O157［17］、沙門 氏 菌［18，19］、副 溶 血 性 弧 菌［20，21］、綠 膿 假 單 胞菌［22］、單核細(xì) 胞 增 多 性 李 斯 特 菌［23］、阪 崎 腸 桿 菌［24］。 目 前已報(bào)道的LAMP技術(shù)主要是采用濁度儀或反應(yīng)后加入顯色劑，根據(jù)濁度或顏色的變化進(jìn)行結(jié)果判斷，濁度法需要較為貴重的濁度儀，而反應(yīng)后加入顯色劑SYBR GreenⅠ，開蓋容易造成氣溶膠污染，反應(yīng)前加入高濃度SYBR GreenⅠ對反應(yīng)有抑制作用。因此，急需建立一種更適合基層使用的反應(yīng)前加入顯色劑，且無需開蓋、無需大型儀器設(shè)備的LAMP擴(kuò)增技術(shù)。

本研究擬采用實(shí)時(shí)熒光LAMP技術(shù)，根據(jù)擴(kuò)增時(shí)間和熒光強(qiáng)度篩選最佳引物組合，并最終運(yùn)用金屬離子指示劑羥基萘酚藍(lán)［25］（hydroxy naphthol blue，HNB）判定反應(yīng)結(jié)果，使LAMP的結(jié)果判斷更簡單直觀，旨為建立適合在基層檢測單位推廣使用的金黃色葡萄球菌LAMP可視化快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸埃希氏桿菌、阪崎腸桿菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、糞腸球菌、副溶血性弧菌：美國典型菌種保藏中心（ATCC）；

鼠傷寒沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、β溶血性鏈球菌、志賀氏菌：中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC）；

大腸埃希氏菌O157：H7：英國國家標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心（NCTC）；

金黃色葡萄球菌：由本實(shí)驗(yàn)室依據(jù)GB/T 4789.10—2010從食品中分離鑒定。

1.2 主要試劑和儀器

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；

DNA等溫?cái)U(kuò)增試劑盒：廣州迪澳生物科技有限公司；

羥基萘酚藍(lán)（HNB）：美國Sigma公司；

DL 1，000DNA Marker、Premix TaqTM：大連寶生物工程有限公司；

超微量核酸蛋白分析儀：BD1000型，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；

干式恒溫器：K30B型，杭州奧盛儀器有限公司；

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：7500FAST型，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 細(xì)菌基因組DNA提取

按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒使用說明書操作。

1.4 LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成

針對金黃色葡萄球菌的特異性基因nuc和femA，參照文獻(xiàn)［26］和SN/T 2754.1—2011中引物序列（見表1），合成2套LAMP引物，用于篩選最佳引物組合，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.5 LAMP體系建立

LAMP反應(yīng)體系25μL，包括：F3、B3濃度為0.2μmol/L，F(xiàn)IP、BIP濃度為1.6μmol/L，LB、LF濃度為0.3μmol/L（無環(huán)引物加雙蒸水補(bǔ)足體積），2×反應(yīng)緩沖液12.5μL，8UBst DNA聚合酶1μL，DNA模板2μL。將反應(yīng)體系于63℃恒溫反應(yīng)45min。實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)體系中加SYTO－9熒光染料0.5μL，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上完成反應(yīng)；顯色法加3mmol/L HNB 0.5μL，在干式恒溫器上完成反應(yīng)。

1.6 靈敏度分析

將100ng/μL的金黃色葡萄球菌基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，使得濃度梯度依次為100，10，1，0.1，0.01，0.001，0.000 1ng/μL。以此為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。平行進(jìn)行PCR法檢測金黃色葡萄球菌靈敏度的試驗(yàn)，對比分析兩種方法的檢測靈敏度。PCR法反應(yīng)體系：2×Premix Taq 12.5μL，引物nuc－F3/nuc－B3（10μmol/L）各0.5μL，100ng DNA模版，補(bǔ)滅菌蒸餾水至25μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃5min。

1.7 特異性分析

利用建立的LAMP法對表2中菌株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證本方法的特異性。同時(shí)，使用金黃色葡萄球菌可視化LAMP檢測法對按照GB/T 4789.10—2010的方法從肉類及蛋奶制品等樣品中分離得到的野生菌株進(jìn)行驗(yàn)證檢測，并平行進(jìn)行普通PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳引物篩選

按上述反應(yīng)體系，以金黃色葡萄球菌DNA為模板，運(yùn)用2套LAMP引物分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP擴(kuò)增，比較其擴(kuò)增效率篩選最佳引物組合，圖1為最佳引物篩選結(jié)果。由圖1可知，nuc、femA引物組的擴(kuò)增出峰時(shí)間分別為11.7，31.6min，而nuc引物組的擴(kuò)增熒光強(qiáng)度明顯高于femA引物組。因此選擇nuc引物組進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 LAMP法與PCR法檢測靈敏度比較

在反應(yīng)前加入HNB作為LAMP擴(kuò)增的指示劑，根據(jù)HNB的顏色變化進(jìn)行結(jié)果判定，陽性呈天藍(lán)色，陰性為紫羅蘭色。用nuc引物組，以金黃色葡萄球菌DNA為模板，用去離子水進(jìn)行10倍系列稀釋，分別進(jìn)行LAMP、PCR法檢測，比較兩者靈敏度，結(jié)果見圖2。由圖2可知，LAMP法和PCR法靈敏度基本相同，都可以達(dá)到0.001ng/μL，但PCR法在0.001ng/μL的電泳條帶較弱。

圖1 最佳引物篩選Figure 1 Screening the best primers

圖2 金黃色葡萄球菌檢測靈敏度結(jié)果Figure 2 Detection sensitivity of Staphylococcus aureus

從試驗(yàn)易操作性、結(jié)果判定直觀角度考慮，LAMP可視化檢測法更適合現(xiàn)場快速檢測。

2.3 LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果

利用建立的金黃色葡萄球菌LAMP法對表2中的13個(gè)種類共計(jì)27株細(xì)菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)，采用去離子水作為陰性對照。其中15株金黃色葡萄球菌為LAMP陽性結(jié)果、其他菌為陰性結(jié)果，與平行進(jìn)行的普通PCR法檢測結(jié)果一致，表明本試驗(yàn)所用的LAMP引物具有高度特異性。

表2 特異性分析結(jié)果Table 2 Results of LAMP specific amplification

3 討論

本研究通過實(shí)時(shí)熒光LAMP法對金黃色葡萄球菌的2套LAMP引物進(jìn)行篩選，比較其出峰時(shí)間、熒光強(qiáng)度確定最佳引物組合。采用在反應(yīng)前添加金屬離子指示劑HNB，通過肉眼直接觀察顏色變化進(jìn)行判定，若反應(yīng)液由紫羅蘭變?yōu)樘焖{(lán)色，即為陽性。本試驗(yàn)建立了金黃色葡萄球菌可視化LAMP反應(yīng)體系，檢測靈敏度為0.001ng/μL，與普通PCR相當(dāng)，且特異性良好，與其他種類的致病菌無交叉反應(yīng)。HNB作為LAMP反應(yīng)顯色劑，結(jié)果易于識別，且與普通PCR一致，說明基于HNB染料的LAMP檢測結(jié)果可信。

本研究建立了金黃色葡萄球菌可視化快速檢測方法，在63℃恒溫條件下反應(yīng)45min便可直接判定結(jié)果，無需特殊儀器設(shè)備，簡便易行，可用于食品安全現(xiàn)場監(jiān)督檢驗(yàn)和基層快速檢測。

1 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會.國家衛(wèi)生計(jì)生委辦公廳關(guān)于2014年全國食物中毒事件情況的通報(bào)［EB/OL］.（2015—02—15）［2015－05－11］.http：//www.nhfpc.gov.cn/yjb/s3585/201502/91fa4b047e984d3a89c16194722ee9f2.shtml.

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