王帥帥鄭小平孟 瑾何亞斌

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海必諾檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 200436）

羊奶營(yíng)養(yǎng)豐富、易于吸收，其蛋白質(zhì)和脂肪含量均高于牛奶，被國(guó)際營(yíng)養(yǎng)學(xué)界稱為“奶中之王”［1］。在中國(guó)奶類產(chǎn)量中，山羊奶是第二大奶類，中國(guó)已成為飼養(yǎng)奶山羊最多的國(guó)家［2］。β－內(nèi)酰胺類抗生素可以治療奶羊乳腺炎、心包炎等疾病，在奶羊養(yǎng)殖過(guò)程中，由于缺乏科學(xué)用藥的知識(shí)，或受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，不合理用藥現(xiàn)象仍很嚴(yán)重［3］。長(zhǎng)期食用含有β－內(nèi)酰胺類抗生素的羊乳會(huì)引起疾病，如過(guò)敏反應(yīng)、致畸反應(yīng)以及增加細(xì)菌的耐藥性［4］。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于羊奶中β－內(nèi)酰胺類抗生素的檢測(cè)報(bào)道較少［5］，牛奶中β－內(nèi)酰胺類抗生素的測(cè)定多采用傳統(tǒng)的固相萃取法（SPE）凈化樣品［6－9］，與傳統(tǒng)的固相萃取凈化法相比，QuEChERS凈化法具有樣品前處理時(shí)間短、節(jié)省溶劑、降低檢測(cè)成本等優(yōu)點(diǎn)。本研究擬在參考牛奶中β－內(nèi)酰胺類抗生素檢測(cè) 方 法［10－13］的 基 礎(chǔ) 上，用 改進(jìn) 的 QuEChERS 凈 化法［14］，結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC—MS/MS）測(cè)定羊奶中8種β－內(nèi)酰胺類抗生素。試驗(yàn)以乙腈為提取試劑，C18和PSA吸附劑凈化處理，具體考察提取試劑、吸附劑類別和用量等條件對(duì)回收率的影響。以期為羊奶中β－內(nèi)酰胺類抗生素的檢測(cè)提供一種快速、可靠的檢測(cè)方法，同時(shí)對(duì)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定亦具有指導(dǎo)意義。羊奶中蛋白質(zhì)和脂肪的含量與牛奶中相差不大，本方法也適用于牛奶中β－內(nèi)酰胺類抗生素的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：Waters XEVO TQ型，ESI源，美國(guó)沃特世公司；

高速冷凍離心機(jī)：Heraeus Multifuge X1R型，美國(guó)熱電公司；

氮吹儀：ANPEL DC12型，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；

超聲波儀：TH型，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

乙腈：色譜純，德國(guó)Merck公司；

甲酸：分析純，美國(guó)Sigma公司；

C18粉、PSA吸附劑：天津博納艾杰爾科技有限公司；

標(biāo)準(zhǔn)品：阿莫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、氨芐西林、頭孢噻呋、青霉素G、苯唑西林、氯唑西林，純度＞98.5%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；

羊奶：市售。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱取8種標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，用50%乙腈水溶液溶解并定容至10mL，即得1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：吸取8種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各100μL，用50%乙腈水溶液溶解并定容至10mL，即得10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用50%乙腈水溶液逐級(jí)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取 稱取5.00g羊奶于50mL離心管中，加入乙腈10mL，渦旋振蕩1min，超聲提取10min，8 000r/min離心5min，上清液待凈化。

1.3.2 凈化 取1.3.1中上清液8mL轉(zhuǎn)移至15mL離心管中（管中預(yù)先加入150mg C18和150mg PSA），渦旋混勻1 min，5 000r/min離心3min，取6mL上清液氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?mL 10%乙腈水溶液復(fù)溶，過(guò)0.22μm有機(jī)相濾膜，上機(jī)分析。

1.4 分析條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTM C18（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；柱溫30℃；流動(dòng)相梯度洗脫程序：0～1min，95%A，1～4min，95%～50%A，4～6min，50%A，6～7min，50%～95%A，7～8min，95%A，進(jìn)樣量：5 μL，流速：0.3mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；毛細(xì)管電壓：1.60kV；離子源溫度：150℃；去溶劑溫度：500℃；去溶劑氣流：氮?dú)猓?00L/h；碰撞氣：氬氣；多反映監(jiān)測(cè)模式（MRM）采集。8種β－內(nèi)酰胺類抗生素的保留時(shí)間、母離子、子離子以及對(duì)應(yīng)的碰撞能量見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

測(cè)定牛奶中β－內(nèi)酰胺類抗生素時(shí)通常使用甲醇/0.1%甲酸水溶液或乙腈/0.1%甲酸水溶液作流動(dòng)相，本試驗(yàn)比較了這兩種流動(dòng)相對(duì)8種β－內(nèi)酰胺類抗生素色譜行為的影響。結(jié)果表明，以甲醇/0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，5種青霉素類化合物響應(yīng)值較低，峰形較差，以乙腈/0.1%甲酸—水溶液為流動(dòng)相時(shí)，8種目標(biāo)化合物分離完全，且峰形較好，故選用乙腈/0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，8種β－內(nèi)酰胺類抗生素的總離子流圖見(jiàn)圖1。

表1 8種β－內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)譜條件Table 1 MS parameters of 8β-lactams

圖1 8種β－內(nèi)酰胺類抗生素總離子流圖Figure 1 Total ion chromatogram （TIC）of 8β-lactams

2.2 樣品處理?xiàng)l件的選擇與優(yōu)化

2.2.1 提取試劑的選擇 試驗(yàn)比較了甲醇、乙腈、1%甲酸乙腈3種提取試劑對(duì)待測(cè)組分回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，乙腈去蛋白的能力較強(qiáng)，提取效果最好，甲醇中的羥基會(huì)加速青霉素的分解，酸性條件下，頭孢類抗生素的提取效果比青霉素類抗生素好，綜合考慮，選擇乙腈作為提取試劑。

2.2.2 吸附劑對(duì)凈化效果的影響 試驗(yàn)比較了C18、PSA和C18＋PSA（1＋1）3種凈化方式對(duì)回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，C18＋PSA（1＋1）混合使用比單獨(dú)使用凈化效果好，這是由于C18主要吸附樣品中的脂肪和蛋白，PSA主要吸附樣品中的脂肪酸和糖類雜質(zhì)，單獨(dú)使用C18或PSA時(shí)，樣品中脂肪和蛋白吸附不完全，存在較大的基質(zhì)效應(yīng)，綜合考慮，選擇C18＋PSA凈化方式凈化樣品。

2.2.3 C18＋PSA（1＋1）吸附劑用量對(duì)凈化效果的影響 試驗(yàn)優(yōu)化了C18＋PSA（1＋1）吸附方式的不同用量對(duì)8種β－內(nèi)酰胺類抗生素的凈化效果，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，當(dāng)C18＋PSA吸附劑為300mg時(shí)，各組分的回收率最高。吸附劑用量為100mg時(shí)，樣品中蛋白和脂肪吸附不完全，吸附劑用量為500mg時(shí)，吸附劑會(huì)吸附樣品中目標(biāo)化合物，導(dǎo)致回收率降低，綜合考慮，選擇吸附劑用量為300mg。

圖2 提取試劑對(duì)提取效果的影響Figure 2 Effect of extraction reagent on extraction efficiency

圖3 吸附劑對(duì)凈化效果的影響Figure 3 Effect of different sorbents on extraction efficiency

圖4 C18＋PSA用量對(duì)凈化效果的影響Figure 4 Effect of weight of C18and PSA on extraction efficiency

2.3 線性范圍和方法檢出限

用空白樣品提取液配制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為1.0，5.0，10.0，25.0，50.0μg/kg。按1.3的方法處理測(cè)定，測(cè)定后以各組分的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X，μg/kg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以信噪比S/N≥3確定方法的檢出限（LOD），以信噪比S/N≥10確定方法的定量限（LOQ），8種β－內(nèi)酰胺類抗生素的方法檢出限為0.25～1.00μg/kg，定量限為1.0～2.0μg/kg。在1.0～50.0μg/kg濃度范圍內(nèi)，8種目標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限見(jiàn)表2。

表2 各化合物的線性方程及方法檢出限Table 2 Linear equations and correlation coefficients

2.4 方法回收率和精密度

用同一空白羊奶樣品做加標(biāo)回收試驗(yàn)，8種β－內(nèi)酰胺類抗生素的添加水平分別設(shè)定為5.0，10.0，25.0μg/kg。按照1.3的方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)添加水平做6個(gè)平行樣，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 8種β－內(nèi)酰胺類抗生素的回收率和精密度Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of 8β-lactams in spiked milk samples（n＝6）

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)15份市售的羊奶進(jìn)行檢測(cè)，按1.3中樣品處理方法操作，各樣品中均未檢測(cè)到8種β－內(nèi)酰胺類抗生素的殘留，說(shuō)明測(cè)定的15份羊奶質(zhì)量較好。

3 結(jié)語(yǔ)

本試驗(yàn)建立了QuEChERS凈化法結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定羊奶中8種β－內(nèi)酰胺類抗生素的方法，該方法使用吸附劑直接凈化樣品，與傳統(tǒng)固相萃取凈化相比，該方法樣品前處理簡(jiǎn)單快速、提高了檢測(cè)效率，同時(shí)也具有較好的回收率和較低的檢出限，方法實(shí)用性較強(qiáng)，為羊奶及其他奶制品中β－內(nèi)酰胺類抗生素的殘留檢測(cè)提供了可靠的方法，對(duì)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定也具有指導(dǎo)性意義。

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