馬　麗，唐　堅(jiān)，王夢(mèng)晗，王凱晨，喬勇進(jìn)，*，鐘敏增

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，上海201403；3.上海塞翁福農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，上海201403）

低溫脅迫對(duì)糙米發(fā)芽及γ-氨基丁酸含量的影響

馬麗1，2，唐堅(jiān)2，王夢(mèng)晗1，2，王凱晨2，喬勇進(jìn)2，*，鐘敏增3

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，上海201403；3.上海塞翁福農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，上海201403）

為了解低溫脅迫對(duì)糙米發(fā)芽率及發(fā)芽糙米中GABA含量的影響，選擇優(yōu)質(zhì)“長(zhǎng)粒香”糙米為實(shí)驗(yàn)材料，以不同低溫脅迫溫度、脅迫時(shí)間和發(fā)芽時(shí)間為影響因素，以發(fā)芽率及GABA含量為指標(biāo)進(jìn)行研究，并利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化糙米發(fā)芽工藝。實(shí)驗(yàn)表明，低溫脅迫能夠促進(jìn)發(fā)芽糙米中GABA的積累，其最佳工藝條件為：脅迫溫度0℃，脅迫時(shí)間2h，發(fā)芽時(shí)間30h。該條件下制得的發(fā)芽糙米中GABA含量為35.16mg/100g，是原料糙米的2.58倍，是對(duì)照組發(fā)芽糙米的1.19倍。

低溫脅迫，芽糙米，發(fā)芽率，γ-氨基丁酸

發(fā)芽糙米是將糙米培養(yǎng)發(fā)芽后所得到的由幼芽和帶糠層胚乳組成的糙米制品。作為一種新型功能性食品資源，糙米發(fā)芽后不僅解決了口感欠佳的問(wèn)題，而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大幅提升[1]。與普通糙米及精米相比，發(fā)芽糙米除含有豐富的維生素、膳食纖維和礦物質(zhì)元素外，還含有以γ-氨基丁酸（GABA）為代表的多種功能性成分。GABA是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，具有活化腦血流、增強(qiáng)腦細(xì)胞代謝、降血壓、抗驚厥等功效，能改善肝腎功能、緩解動(dòng)脈硬化、預(yù)防慢性酒精中毒，并對(duì)失眠、更年期障礙和老年期精神障礙有改善作用[2-3]。

由于GABA具有多種生理、藥理與保健功能，發(fā)芽糙米一經(jīng)推出便引發(fā)了人們的極大關(guān)注。在日本，發(fā)芽糙米已進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化、商品化階段，目前有多家公司進(jìn)行生產(chǎn)和銷售；在我國(guó)，雖然處于研究的起步階段，但近十多年卻對(duì)發(fā)芽糙米及相關(guān)制品的研究十分重視[4]。如胡秀娟[5]、韓濤等[6]用響應(yīng)面法對(duì)糙米發(fā)芽工藝進(jìn)行了優(yōu)化；王琛[7]研究了浸泡液pH對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響；鄧宇[8]、蔣靜等[9]通過(guò)添加Ca2+、磷酸吡哆醛、谷氨酸鈉等外源物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)GABA的積累；張強(qiáng)[10]則利用通氣處理的方法提高了發(fā)芽糙米中GABA的含量，這些研究都對(duì)提高發(fā)芽糙米中GABA的含量具有積極意義。除上述方法外，研究表明[11]，干旱、低溫脅迫、機(jī)械刺激、低氧等逆境條件均可引起植物體中GABA的積累，但目前利用逆境脅迫增加發(fā)芽糙米中GABA的研究卻并不多，而通過(guò)低溫處理來(lái)增加發(fā)芽糙米中GABA的研究更是鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以“長(zhǎng)粒香”糙米為原料，通過(guò)低溫脅迫后浸泡發(fā)芽，研究低溫脅迫對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響，為發(fā)芽糙米中GABA的積累提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)與應(yīng)用依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

糙米長(zhǎng)粒香，上海塞翁福農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供；GABA標(biāo)品含量≥98.0%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯酚、次氯酸鈉溶液（有效氯5.6%）、硼砂、硼酸、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

FORMA-725超低溫冰箱美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；KK29E-18T1型冰箱德國(guó)SIEMENS公司；BC/BD-220GSA冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜青島海爾特種電冰柜有限公司；HWS24型恒溫水浴鍋上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LHS-80HC恒溫恒濕培養(yǎng)箱

上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BP301S型電子天平德國(guó)賽多利斯公司；ZHWY-2102C雙層恒溫?fù)u床上海智成分析儀器制造有限公司；TDZ4-WS臺(tái)式離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Ultrospec 3300 pro紫外分光光度計(jì)美國(guó)安瑪西亞公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)芽糙米的制備將原料“長(zhǎng)粒香”糙米進(jìn)行篩選，剔除不完整粒、無(wú)胚粒等不合格籽粒及雜質(zhì)后，自來(lái)水清洗3次，除去麩皮、糠粉等，于1%NaClO溶液中浸泡10min消毒后，用蒸餾水清洗四次，瀝干表面水分，平鋪于塑料盤(pán)中置于不同溫度下進(jìn)行低溫脅迫，處理后糙米轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入2倍體積蒸餾水于30℃下恒溫浸泡8h；浸泡后的糙米均勻平鋪在墊有4層濕紗布的培養(yǎng)皿中，并蓋上濕紗布，放于30℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)。發(fā)芽結(jié)束后取樣計(jì)算發(fā)芽率，50℃熱風(fēng)干燥1.5h，待發(fā)芽糙米冷卻至室溫后置于密封袋中4℃冰箱存放備用。

對(duì)照組糙米無(wú)需進(jìn)行低溫脅迫，清洗后直接浸泡、發(fā)芽，發(fā)芽時(shí)間與正交實(shí)驗(yàn)后得出的最佳發(fā)芽時(shí)間相同。

1.2.2低溫脅迫溫度對(duì)糙米發(fā)芽及GABA含量影響實(shí)驗(yàn)洗凈瀝干的原料糙米分別置于10、0、-5、-20、-70℃下處理2h后，30℃條件下浸泡8h、發(fā)芽24h后測(cè)定發(fā)芽率及GABA含量，并根據(jù)測(cè)定結(jié)果選擇適當(dāng)溫度展開(kāi)進(jìn)一步研究。每個(gè)處理組3個(gè)平行。

1.2.3低溫脅迫時(shí)間對(duì)糙米發(fā)芽及GABA含量影響實(shí)驗(yàn)將洗凈瀝干的原料糙米置于-5℃下低溫脅迫0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h，30℃條件下浸泡8h、發(fā)芽24h后測(cè)定發(fā)芽率及GABA含量，每個(gè)處理組3個(gè)平行。

1.2.4發(fā)芽時(shí)間對(duì)糙米發(fā)芽及GABA含量影響實(shí)驗(yàn)將洗凈瀝干的原料糙米置于-5℃下低溫脅迫2h，30℃下浸泡8h后于30℃下培養(yǎng)發(fā)芽，分別于發(fā)芽12、18、24、30、36、42、48h時(shí)測(cè)定GABA含量，每個(gè)處理組3個(gè)平行。

1.2.5低溫脅迫積累GABA工藝條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)以糙米發(fā)芽率和發(fā)芽糙米中GABA含量為指標(biāo)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定脅迫溫度、脅迫時(shí)間及發(fā)芽時(shí)間等三因素水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)。由于所選因素水平均能使糙米發(fā)芽率維持在90%以上，所以正交實(shí)驗(yàn)以GABA含量為指標(biāo)，對(duì)其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，具體因素水平見(jiàn)表1。

表1　糙米發(fā)芽正交實(shí)驗(yàn)因素與水平L9（34）Table.1　Orthogonal test factors and levels of brown rice sproutL9（34）

1.2.6發(fā)芽率測(cè)定每組隨機(jī)取100～150粒糙米，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽粒數(shù)及總粒數(shù)，計(jì)算發(fā)芽粒數(shù)占總粒數(shù)的百分率，即為發(fā)芽率。每個(gè)處理組3個(gè)平行。

1.2.7GABA含量測(cè)定GABA含量以發(fā)芽糙米干基計(jì)。測(cè)定方法參考陳恩成[12]和許建軍[13]的方法并加以改進(jìn)，將發(fā)芽糙米樣品粉碎后取1.0g于帶蓋離心管中，加5mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液于搖床上振蕩浸提2h，4000r/min離心10min后取上清液0.5mL，加入0.2mmol/L pH9.0的硼酸緩沖液0.2mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液1mL，有效氯含量為5.6%的NaClO溶液0.2mL，充分振蕩，沸水浴10min，再立即冰水浴20min并不斷振蕩，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液2mL，再次振蕩均勻，靜置后于645nm處測(cè)定吸光度值。

2　結(jié)果與分析

2.1GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別配制濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.7的方法測(cè)定吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x），單位mg/mL，吸光度值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=3.7652x+0.0209，R2=0.9997。

2.2低溫脅迫因素對(duì)糙米發(fā)芽及GABA含量的影響

2.2.1低溫脅迫溫度對(duì)糙米發(fā)芽及GABA含量的影響選擇10、0、-5、-20、-70℃為脅迫溫度進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，-5℃處理下糙米發(fā)芽率良好，而-20℃時(shí)發(fā)芽率明顯下降，0℃時(shí)GABA含量高于10℃，于是增加5、-10、-15℃展開(kāi)進(jìn)一步研究。所有溫度下糙米發(fā)芽率及GABA含量如圖1所示。從圖1中能夠看出，脅迫溫度為-5℃以上時(shí)，糙米發(fā)芽率均在92%以上，且無(wú)顯著性差異（p＞0.05），-10℃時(shí)發(fā)芽率為87.35%，而-15、-20、-70℃時(shí)發(fā)芽率下降明顯，分別為47.44%、29.03%和19.21%，這可能是糙米細(xì)胞被過(guò)低溫度破壞造成的。0℃和-5℃處理組GABA含量高于其他處理組，分別為28.56、27.68mg/100g。5℃時(shí)GABA含量雖與-10℃無(wú)顯著性差異（p＞0.05），但發(fā)芽率高于-10℃，因此正交實(shí)驗(yàn)選擇-5、0、5℃三個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化。

圖1　脅迫溫度對(duì)糙米發(fā)芽率和GABA含量的影響Fig.1　Effect of stress temperature on germinating rates and the content of GABA

Wallace W等[14]的研究表明，低溫脅迫可以通過(guò)改變植物細(xì)胞內(nèi)的隔室化來(lái)實(shí)現(xiàn)GABA的積累，因此細(xì)胞區(qū)域化作用是調(diào)節(jié)GABA積累的一種潛在機(jī)制。低溫對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成了破壞，細(xì)胞質(zhì)pH降低，催化GABA合成的谷氨酸脫羧酶（GAD）被激活，有利于谷氨酸脫羧生成GABA，同時(shí)催化其轉(zhuǎn)氨降解的酶活性受到抑制，GABA轉(zhuǎn)氨作用減弱，使GABA得以大量積累。低溫還可使植物細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度上升，Ca2+增多有利于形成有活性的Ca2+與CaM復(fù)合體，而Ca2+與CaM復(fù)合體同樣能夠激活GAD[15]，提高其活性，進(jìn)而誘導(dǎo)GABA的產(chǎn)生與積累。實(shí)驗(yàn)中0℃、-5℃脅迫條件下發(fā)芽糙米中GABA含量顯著高于其他處理組的原因可能是由于脅迫溫度較高時(shí)，糙米對(duì)外界逆境環(huán)境反應(yīng)不強(qiáng)，GAD激活不徹底，導(dǎo)致其在發(fā)芽過(guò)程中對(duì)GABA積累的誘導(dǎo)效果不理想；而過(guò)低的脅迫溫度又對(duì)糙米內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)造成了嚴(yán)重破壞，進(jìn)而使得GABA積累效果不佳。而-10℃以下低溫處理時(shí)，糙米發(fā)芽率嚴(yán)重下降，這可能是由于過(guò)低溫度破壞了糙米細(xì)胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的。

2.2.2低溫脅迫時(shí)間對(duì)糙米發(fā)芽及GABA含量影響相同脅迫溫度下，不同脅迫時(shí)間對(duì)糙米發(fā)芽率及發(fā)芽糙米GABA含量的影響如圖2所示。從圖2可得，脅迫時(shí)間在4h以內(nèi)時(shí)，糙米發(fā)芽率均高于92%，但處理6h時(shí)發(fā)芽率降為87.14%，并隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷降低，至24h僅為75.97%，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的低溫狀態(tài)抑制了糙米的發(fā)芽活力。低溫脅迫2h和4h時(shí)，發(fā)芽糙米中GABA含量較其他處理組高，分別為27.68、27.02mg/100g，而脅迫時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)，GABA含量均低于2～4h時(shí)。引起這種差異的可能是因?yàn)樵谙嗤拿{迫溫度下，處理時(shí)間較短，GAD激活不徹底，致使糙米浸泡發(fā)芽過(guò)程中GABA生成效果不佳，含量較低；處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，糙米長(zhǎng)期處在逆境之中，自身需要大量合成GABA以抵抗逆境環(huán)境，這些GABA氧化降解形成琥珀酸，為T(mén)CA循環(huán)提供所需碳源，使逆境環(huán)境下TCA循環(huán)得以順利進(jìn)行[16]。該過(guò)程造成了GABA及其合成原料的消耗，使得以該糙米為原料制備的發(fā)芽糙米中GABA含量與其他處理組相比有所下降。綜合發(fā)芽率和GABA含量?jī)身?xiàng)指標(biāo)，選擇2、3、4h為正交實(shí)驗(yàn)中脅迫時(shí)間的因素水平。

圖2　脅迫時(shí)間對(duì)糙米發(fā)芽率和GABA含量的影響Fig.2　Effect of stress time on germinating rates and the content of GABA

圖3　發(fā)芽時(shí)間對(duì)糙米發(fā)芽率和GABA含量的影響Fig.3　Effect of germinating time on germinating rates and the content of GABA

2.2.3發(fā)芽時(shí)間對(duì)糙米發(fā)芽及GABA含量影響將-5℃脅迫2h的原料糙米置于30℃下浸泡8h并于30℃進(jìn)行發(fā)芽，自12h時(shí)起每隔6h取樣測(cè)定其發(fā)芽率及GABA含量，結(jié)果如圖3所示。由圖3可得，發(fā)芽12h時(shí)，糙米發(fā)芽率已可達(dá)90%以上，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)芽率雖然逐漸上升，但發(fā)芽24h后上升并不明顯（p＞0.05），至48h時(shí)僅增長(zhǎng)1.31%，因此發(fā)芽時(shí)間在12h以上即可。而發(fā)芽糙米中GABA含量呈30h前不斷上升，30～36h降低，36h后再逐漸上升的變化規(guī)律，對(duì)此，鄭向華等[17]也得到了類似的變化規(guī)律。對(duì)于第一階段的增長(zhǎng)，可能是糙米發(fā)芽過(guò)程中GABA不斷合成積累的結(jié)果；但隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，谷氨酸脫羧酶活力逐漸下降，用于合成GABA的底物不斷減少，30h后，GABA合成率低于降解率，總含量開(kāi)始降低；而36h后，發(fā)芽糙米中的一些物質(zhì)成分開(kāi)始分泌出來(lái)，隨著分泌量的逐漸增多，GABA在發(fā)芽糙米中的相對(duì)含量不斷增加，因此測(cè)得發(fā)芽36h后GABA含量再次增加。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，36h后，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)芽糙米不僅芽長(zhǎng)不斷增長(zhǎng)，米身也開(kāi)始出現(xiàn)起泡、變黃、發(fā)粘等現(xiàn)象，并伴有發(fā)酵的異味產(chǎn)生，嚴(yán)重影響發(fā)芽糙米的感官性狀及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，因此應(yīng)將發(fā)芽時(shí)間控制在36h以內(nèi)為宜，此時(shí)發(fā)芽率已達(dá)到90%以上，商品性良好。所以選定正交實(shí)驗(yàn)中發(fā)芽時(shí)間的水平條件分別為24、30、36h。

2.3低溫脅迫積累GABA工藝條件優(yōu)化

單因素實(shí)驗(yàn)可以看出，低溫脅迫對(duì)發(fā)芽糙米中GABA的積累具有促進(jìn)作用，因此在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)通過(guò)低溫脅迫促進(jìn)發(fā)芽糙米GABA積累技術(shù)的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　GABA含量正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table.2　Result of orthogonal test of GABA content

表3　GABA含量方差分析表Table.3　Anova of GABA content

從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，影響發(fā)芽糙米中GABA含量的主次關(guān)系為：發(fā)芽時(shí)間＞脅迫溫度＞脅迫時(shí)間，最優(yōu)組合為：A2B1C2。在30℃下浸泡8h后于30℃進(jìn)行發(fā)芽的條件下，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，此時(shí)得到的發(fā)芽糙米中GABA含量為35.16mg/100g。即低溫脅迫發(fā)芽糙米中積累GABA的最佳工藝為：脅迫溫度0℃，脅迫時(shí)間2h，發(fā)芽時(shí)間30h。表3方差分析表明，3個(gè)因素對(duì)GABA含量的影響均不顯著。

3　結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)糙米進(jìn)行低溫脅迫后發(fā)芽，可促進(jìn)發(fā)芽糙米中GABA含量的增加，且以0～-5℃處理2～4h效果為佳，溫度較高，積累作用不明顯，溫度過(guò)低，不僅積累效果不佳，還會(huì)嚴(yán)重影響糙米發(fā)芽率；發(fā)芽時(shí)間以24～36h為宜，時(shí)間較短，積累作用同樣不明顯，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)芽糙米會(huì)出現(xiàn)變黃發(fā)粘、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量溶出等現(xiàn)象，嚴(yán)重降低發(fā)芽糙米的商品性狀及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在30℃浸泡8h后，于30℃發(fā)芽的條件下，通過(guò)低溫脅迫積累GABA的最佳工藝條件為：0℃下低溫脅迫2h，發(fā)芽30h，此時(shí)發(fā)芽糙米中GABA含量為35.16mg/100g。實(shí)驗(yàn)所用原料糙米中GABA含量為13.63mg/100g，對(duì)照組發(fā)芽糙米中GABA含量為29.54mg/100g。該工藝條件下制得的發(fā)芽糙米中，GABA含量為原料糙米的2.58倍，為對(duì)照發(fā)芽糙米的1.19倍，積累效果顯著，這為發(fā)芽糙米生產(chǎn)新工藝提供了有力的參考依據(jù)。

通過(guò)低溫脅迫促進(jìn)發(fā)芽糙米中GABA的積累，操作方便，簡(jiǎn)單易行，可單獨(dú)使用，亦可與其他方法結(jié)合使用，具有良好的研究?jī)r(jià)值與廣闊的發(fā)展前景。

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Effect of low temperature stress on germination and content of GABA in germinated brown rice

MA Li1，2，TANG Jian2，WANG Meng-han1，2，WANG Kai-chen2，QIAO Yong-jin2，*，ZHONG Min-zeng3
（1.Department of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China；2.Agricultural Products Storage and Processing Research Center，Shanghai Academy of Agriculture Science，Shanghai 201403，China；3.Shanghai SaiWengFu Agricultural Development Co.，Ltd.，Shanghai 201403，China）

Effects of low temperature stress on germinating rates of brown rice and the content of GABA in germinated brown rice was studied in this paper，with“Long grain fragrant”brown rice as material，different stress temperature，stress time，and germinating time as factors，germinating rates and the content of GABA as indicators.The processing technological parameter of the germination of brown rice was optimized by using orthogonal design.The results showed that GABA in germinated brown rice could be accumulated by low temperature stress，and the optimum formulation was stress temperature 0℃，stress time 2h，germinating time 30h.Under the condition，the content of GABA in germinated brown rice could reach to 35.16mg/100g，it was 2.58 times than brown rice，and 1.19 times than control germinated brown rice.

low temperature stress；germinated brown rice；germinating rates；GABA

TS210.1

B

1002-0306（2015）04-0278-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.052

2014－07－15

馬麗（1988-），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與保鮮。

喬勇進(jìn)（1967-），男，博士，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。

上海市科委國(guó)際合作項(xiàng)目（1073907003）。