顧　云，孫虹霞，梁　昱，劉　昕

（中山大學(xué)生命科學(xué)大學(xué)院，廣東廣州510275）

GU Yun，SUN Hong-xia，LIANG Yu，LIU Xin*

（Grand School of Life Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China）

大孔樹脂純化管花肉蓯蓉毛蕊花糖苷的工藝研究

顧云，孫虹霞，梁昱，劉昕*

（中山大學(xué)生命科學(xué)大學(xué)院，廣東廣州510275）

本研究旨在探索大孔樹脂純化管花肉蓯蓉毛蕊花糖苷的方法。通過靜態(tài)實(shí)驗(yàn)篩選純化毛蕊花糖苷的最佳樹脂類型，并從洗脫劑濃度、洗脫時(shí)間、洗脫速度三個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化以得到該樹脂動態(tài)洗脫毛蕊花糖苷的最佳方法。結(jié)果顯示：HPD300對毛蕊花糖苷的吸附和解吸能力最強(qiáng)，其純化毛蕊花糖苷的最優(yōu)條件為：吸附平衡后經(jīng)超純水洗脫30min，之后依次用20%和50%的乙醇洗脫75min和60min，流速為10mL/min。純化后，毛蕊花糖苷的含量由5.26%提高至68.20%，回收率為68.90%。研究結(jié)果表明，采用大孔樹脂HPD300純化管花肉蓯蓉毛蕊花糖苷，成本低，回收率和純度較高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

管花肉蓯蓉，毛蕊花糖苷，大孔樹脂，純化

GU Yun，SUN Hong-xia，LIANG Yu，LIU Xin*

（Grand School of Life Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China）

管花肉蓯蓉[Cistanche tubulosa（Schrenk）Wight]是列當(dāng)科（Orobanchaceae）肉蓯蓉屬（Cistanche）多年生草本植物，是名貴的補(bǔ)益中草藥。以松果菊苷和毛蕊花糖苷為代表的苯乙醇苷類物質(zhì)是管花肉蓯蓉的主要活性成分。研究發(fā)現(xiàn)管花肉蓯蓉毛蕊花糖苷具有消炎、抗氧化、降低2型糖尿病小鼠血糖血脂等藥理功效[1-6]，但是管花肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的含量偏低。目前，國內(nèi)外研究者通常采用色譜技術(shù)分離純化以得到純度和回收率較高的苯乙醇苷（主要指松果菊苷和毛蕊花糖苷）[7-11]，但是該技術(shù)工藝復(fù)雜，純化過程需要使用多種有機(jī)溶劑，成本昂貴，不適用于工業(yè)生產(chǎn)。與此同時(shí)，大孔樹脂也已經(jīng)運(yùn)用于苯乙醇苷的分離純化[12-15]，技術(shù)成熟，成本低，且純化過程只使用一種有機(jī)溶劑，適用于工業(yè)化生產(chǎn)；這些研究涉及到苯乙醇苷總苷的富集、松果菊苷的純化，但是尚未涉及毛蕊花糖苷的純化，本研究擬采用大孔樹脂純化毛蕊花糖苷粗樣，以期得到高純度的毛蕊花糖苷。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

毛蕊花糖苷樣品制備按照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法進(jìn)行制備，制備后樣品溶液中毛蕊花糖苷的含量為5.26%±0.091%，濃度為7.57±0.21mg/mL，保存于4℃冰箱；乙醇和冰乙酸分析純；甲醇MERCK，色譜純；大孔樹脂HPD300，D101，AB-8，S-8購自河北滄州寶恩生物有限公司。

中壓制備色譜系統(tǒng)BUCHI公司；高效色相色譜系統(tǒng)美國Waters公司；恒溫?fù)u床ZMY-2102C上海智誠有限公司；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀LABORRTA4001 Heidolph公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量檢測松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量按照高效液相色譜法[16]測定：Symmetry C18（5μm）色譜柱，Waters 1525色譜泵，2996紫外檢測器；流動相：0.5%乙酸（A），甲醇（B）；梯度洗脫條件：75%～60%A（0～10min），60%A（10～30min）；檢測波長：330nm；柱溫：30℃。

1.2.2大孔樹脂的預(yù)處理和含水量測定為了除去樹脂中殘留的交聯(lián)劑和致孔劑等有機(jī)溶劑，參照Lin等[17]的方法及產(chǎn)品的使用說明書進(jìn)行大孔樹脂的預(yù)處理：首先用無水乙醇浸泡24h，使樹脂充分溶脹；之后用去離子水洗滌至無乙醇?xì)埩?。將處理過的樹脂搖勻，吸干表面水分，每種樹脂精確稱取3份，記質(zhì)量為W1；80℃烘干至恒重，稱重，記質(zhì)量為W2，按照公式（1）計(jì)算含水量（%）。

1.2.3靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)稱取一定量預(yù)處理過的樹脂（相當(dāng)于1.0g干重）于三角瓶中，加50mL樣品溶液，120r/min室溫振蕩24h，過濾，測定濾液中毛蕊花糖苷的含量，根據(jù)公式（2）計(jì)算飽和吸附量。將吸附飽和的樹脂用去離子水洗滌，加50mL 95%的乙醇，120r/min室溫振蕩24h，過濾，測定濾液中毛蕊花糖苷的含量，根據(jù)公式（3）和（4）計(jì)算解吸量和解吸率。

其中，C0（mg/mL）和Ce（mg/mL）分別是初始以及吸附平衡后溶液中毛蕊花糖苷的濃度，Vi（mL）是初始樣品體積，W（g）是樹脂質(zhì)量，Cd（mg/mL）是解吸溶液中毛蕊花糖苷的濃度，Vd是解吸溶液的體積（mL）。

根據(jù)靜態(tài)實(shí)驗(yàn)選擇最佳樹脂型號，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用樹脂。

1.2.4預(yù)處理后HPD300的有機(jī)溶劑殘留物檢測目前常見的大孔樹脂預(yù)處理大都以“加數(shù)倍水于乙醇溶液中不顯混濁”或“至200～400nm無紫外吸收峰”為合格標(biāo)準(zhǔn)[18]，賈存勤與鄧亮等[18-19]發(fā)現(xiàn)，對預(yù)處理后的大孔樹脂進(jìn)行全波長掃描，若吸光值小于0.2，則氣相色譜法檢測不出苯、二甲苯等有機(jī)溶劑的殘留。以后者為標(biāo)準(zhǔn)，在預(yù)處理后的大孔吸附樹脂中加入無水乙醇（高出樹脂5cm），置于恒溫振蕩器上充分振蕩，過濾，濾液進(jìn)行全波長掃描（200～800nm），檢測預(yù)處理后樹脂的有機(jī)溶劑的殘留情況。

1.2.5靜態(tài)吸附動力學(xué)稱取一定量預(yù)處理過的樹脂（相當(dāng)于1.0g干重）于三角瓶中，加50mL樣品溶液，120r/min室溫振蕩16h。每隔1h測定溶液中毛蕊花糖苷的含量并計(jì)算吸附能力。以吸附能力為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

擬合準(zhǔn)一級動力學(xué)和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型，以更好地了解吸附過程并確定樹脂的吸附類型[20-23]。

兩種模型的公式分別為（5）和（6）：其中，k1和k2分別是準(zhǔn)一級動力學(xué)模型和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型的速度常數(shù)，qe是理論平衡吸附值，qt是不同時(shí)間的吸附值，t是吸附時(shí)間。

1.2.6吸附等溫線稱取8份一定量預(yù)處理過的樹脂（相當(dāng)于1.0g干重）于8個(gè)三角瓶中，分別添加50mL 8種不同濃度的樣品溶液，120r/min振蕩24h，溫度分別為25、35、45℃。記錄初始濃度和吸附平衡時(shí)的濃度。參照公式分別對Langmuir（7）和Freundlich（8）吸附模型進(jìn)行評估，

其中，Qe（mg/g）是平衡吸附量，qm（mg/g）是理論計(jì)算出來的最大吸附能力，Ce（mg/mL）是平衡濃度，KL是Langmuir常數(shù)，KF和1/n是Freundlich常數(shù)。

1.2.7動態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)稱取一定質(zhì)量預(yù)處理的大孔樹脂HPD300，濕法裝柱，上樣，吸附平衡后用超純水洗脫，之后用不同濃度的乙醇（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）進(jìn)行連續(xù)洗脫，洗脫時(shí)間均為30min，洗脫速度為10mL/min，制作解吸曲線以確定洗脫雜質(zhì)和毛蕊花糖苷的乙醇濃度；分別以5、10、15mL/min的速度及確定濃度的乙醇進(jìn)行不同時(shí)間的洗脫，以此確定最佳洗脫速度和洗脫時(shí)間。按照式（9）和式（10）計(jì)算純化后毛蕊花糖苷的純度和回收率。

其中，W1和W2指純化后樣品中毛蕊花糖苷的質(zhì)量和樣品的總質(zhì)量，W3指純化前樣品中毛蕊花糖苷的質(zhì)量。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行ANOVA單因素方差分析和多重比較分析，數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用Excel 2010作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1大孔樹脂含水量

樹脂的吸附特性跟樹脂的結(jié)構(gòu)和極性等理化性質(zhì)有著非常密切的關(guān)系。按照方法1.2.2進(jìn)行四種類型大孔樹脂的含水量測定，總結(jié)其理化性質(zhì)如表1。

2.2靜態(tài)吸附和解吸能力

樹脂的吸附特性跟樹脂的結(jié)構(gòu)和極性等有密切的關(guān)系，選擇四種理化性質(zhì)不同的樹脂，從中篩選對毛蕊花糖苷吸附和解吸能力最強(qiáng)的樹脂。HPD300對毛蕊花糖苷的吸附能力、解吸能力以及解吸率分別為（49.19±1.56）mg/g，（46.97±0.87）mg/g，（95.52±1.63）%（圖1），均顯著大于AB-8、D101和S-8（p＜0.05）。樹脂、待吸附物質(zhì)和溶劑之間通過范德華力或者氫鍵相互作用[24]，從而影響吸附作用，根據(jù)“相似相容”原理[25]，相對于強(qiáng)極性的S-8和非極性的D101，弱極性的HPD300和AB-8對于極性相對較低的毛蕊花糖苷具有較強(qiáng)的吸附和解吸能力。而HPD300優(yōu)于AB-8，可能是由于HPD300在比表面積方面的優(yōu)勢。因此，選擇樹脂HPD300做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1　實(shí)驗(yàn)樹脂的理化性質(zhì)Table.1　Physical properties of the tested macroporous resins

圖1　不同型號樹脂對毛蕊花糖苷的吸附/解吸能力和解吸率Fig.1　Adsorption/desorption capacities and desorption ratios of acteoside on different resins

2.3預(yù)處理后HPD300有機(jī)溶劑殘留的檢測

新購買的大孔樹脂可能會有反應(yīng)不完全的交聯(lián)劑、致孔劑、分散劑等殘留在樹脂空穴內(nèi)，直接使用會危害人體健康[26-27]，因此在使用前必須要進(jìn)行預(yù)處理并檢測處理后有機(jī)溶劑的殘留量是否達(dá)到國家食品藥品監(jiān)督管理局的要求。對預(yù)處理后HPD300有機(jī)溶劑殘留進(jìn)行檢測，全波長掃描結(jié)果見圖2，在200～800nm之間吸光值均未超過0.2，可以說明預(yù)處理后的HPD300的有機(jī)溶劑殘留量符合國家食品藥品監(jiān)督管理局的要求，可以正常使用。

圖2　預(yù)處理后HPD300的紫外光譜掃描圖（200～800nm）Fig.2　Ultraviolet spectrum scan（200～800nm）of pretreated HPD300

2.4靜態(tài)吸附動力學(xué)

按照方法1.2.5進(jìn)行HPD300靜態(tài)吸附動力學(xué)實(shí)驗(yàn)，得到吸附動力學(xué)曲線（圖3），HPD300對毛蕊花糖苷的吸附量隨著時(shí)間的增加而增加，在1h達(dá)到對毛蕊花糖苷的一個(gè)吸附峰值（52.93±1.20）mg/g，在3h時(shí)達(dá)到最大吸附值（59.29±1.42）mg/g，之后對毛蕊花糖苷的吸附量沒有顯著增加。

圖3　HPD300靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線Fig.3　The adsorption kinetics curve of HPD300

擬合動力學(xué)模型的參數(shù)見表2。兩種模型的相關(guān)系數(shù)均趨近于1（R2＞0.99），說明這兩種模型都可以用來描述HPD300對毛蕊花糖苷的吸附作用，但是，準(zhǔn)一級動力學(xué)模型中的qe更接近于實(shí)驗(yàn)值。因此，HPD300對肉蓯蓉苯乙醇苷的吸附更符合準(zhǔn)一級動力學(xué)模型。

表2　準(zhǔn)一級動力學(xué)模型和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型動力學(xué)參數(shù)Table.2　Kinetic parameters of pseudo-fisrt order and pseudo-second order model

2.5吸附等溫線

為了更好地理解大孔樹脂HPD300對毛蕊花糖苷的吸附特點(diǎn)，采用8種不同濃度的樣品（毛蕊花糖苷的濃度0.2701～1.8909mg/mL），與HPD300混合后振蕩24h，轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度分別為25、35、45℃，吸附平衡后，計(jì)算平衡吸附量，以初始濃度值為橫坐標(biāo)，平衡吸附量為縱坐標(biāo)，繪制曲線（圖4），當(dāng)C0為0.28～0.97mg/mL時(shí)，隨著溫度的升高，HPD300對毛蕊花糖苷的吸附量無顯著增加（p＞0.05），當(dāng)C0為1.11～1.95mg/mL時(shí)，隨著溫度的升高，HPD300對毛蕊花糖苷的吸附量顯著增加（p＜0.05）。

擬合Langmuir和Freundlich方程，參數(shù)見表3?？梢钥闯?，大孔樹脂HPD300對毛蕊花糖苷的吸附更趨近于Freundlich模型，即多分子層不均勻吸附，n值大于1，說明HPD300對毛蕊花糖苷的吸附是有利吸附[28]。

圖4　大孔吸附樹脂HPD300對毛蕊花糖苷的吸附等溫線Fig.4　Adsorption isotherms of acteoside on HPD300

表3　大孔吸附樹脂HPD300對毛蕊花糖苷的吸附等溫線參數(shù)Table.3　Adsorption isotherm parameters of acteoside on HPD300

2.6動態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)

為了降低流動相乙醇的使用量，并且更有效的完成洗脫過程，考察了不同濃度乙醇對毛蕊花糖苷的洗脫效率（圖5）。20%的乙醇開始洗脫出少量的毛蕊花糖苷，洗脫率為1.19%；隨著乙醇濃度的升高，對毛蕊花糖苷的洗脫率逐漸增加，到50%時(shí)達(dá)到最大值，達(dá)95.51%。因此，選擇20%和50%的乙醇分別進(jìn)行雜質(zhì)和毛蕊花糖苷的洗脫。

圖5　不同濃度的乙醇對毛蕊花糖苷的解吸率Fig.5　Desorption rates of acteoside by ethanol with different concentrations

吸附平衡后，先用超純水洗脫，之后依次用20%和50%的乙醇進(jìn)行雜質(zhì)和毛蕊花糖苷的洗脫，洗脫速度分別為5、10、15mL/min，洗脫曲線如圖6和圖7。

圖6　20%乙醇對毛蕊花糖苷的解吸曲線Fig.6　Desorption curves of acteoside by 20%ethanol

表4　不同流速洗脫雜質(zhì)所需時(shí)間和乙醇Table.4　The needed time and quantity of ehtanol to elute impurities with different flow rates

表5　不同流速洗脫毛蕊花糖苷的比較Table.5　Compare of eluting acteoside with different flow rates

以毛蕊花糖苷的解吸率不超過2%為標(biāo)準(zhǔn)，確定雜質(zhì)洗脫時(shí)間。速度不同時(shí)，洗脫雜質(zhì)所需時(shí)間和乙醇量見表4，洗脫毛蕊花糖苷所需時(shí)間和乙醇量、毛蕊花糖苷的回收率和純度見表5。當(dāng)流速為15mL/min時(shí)，回收率和純度降低，可能是因?yàn)榱魉偬?，超純水已?jīng)洗脫出部分毛蕊花糖苷。因此，采用流速為10mL/min，此時(shí)進(jìn)行雜質(zhì)和毛蕊花糖苷的乙醇洗脫，乙醇濃度為20%和50%，洗脫時(shí)間分別為75min和60min，毛蕊花糖苷的回收率和純度分別為（68.90±1.02）%和（68.20±2.01）%。

圖7　50%乙醇對毛蕊花糖苷的解吸曲線Fig.7　Desorption curves of acteoside by 50%ethanol

3　結(jié)論與討論

本研究通過靜態(tài)實(shí)驗(yàn)篩選出對管花肉蓯蓉毛蕊花糖苷吸附和解吸能力最強(qiáng)的樹脂HPD300，并建立了HPD300純化毛蕊花糖苷的方法：吸附平衡后經(jīng)超純水洗脫30min，之后依次用20%和50%的乙醇洗脫75min和60min，洗脫速度為10mL/min。

Liu等[12]采用大孔樹脂制備管花肉蓯蓉苯乙醇苷，將毛蕊花糖苷的含量提高至15.17%，回收率為90.17%；卿德剛等[15]采用大孔樹脂純化管花肉蓯蓉松果菊苷，純度和回收率分別為32.6%和91.4%。本研究經(jīng)過大孔樹脂純化后，毛蕊花糖苷的回收率和純度分別為（68.90±1.02）%和（68.20±2.01）%，純度較高，但是回收率較低，原因可能是回收產(chǎn)物不夠細(xì)致，放棄了應(yīng)該保留的部分洗脫液；產(chǎn)物的回收率和純度均有一定的提升空間，可以從樣品的前處理、增加待篩選大孔樹脂類型、梯度洗脫等方面進(jìn)行進(jìn)一步的探索，以提高毛蕊花糖苷的純度和回收率。

Li等[7]和Han等[9]采用高速逆流色譜技術(shù)進(jìn)行毛蕊花糖苷的純化，純度和回收率均達(dá)到90%以上，但是該技術(shù)成本高，且純化過程使用多種有機(jī)溶劑，比如乙酸乙酯、正己烷等，均有一定的毒性，不適用于食品和保健品成分的分離純化；雷厲等[10]和任璐[11]結(jié)合柱層析和色譜技術(shù)進(jìn)行毛蕊花糖苷和松果菊苷的純化，產(chǎn)物的純度和回收率均達(dá)到90%以上，但是純化過程復(fù)雜，需要反復(fù)過柱，也需要使用多種有機(jī)溶劑，同樣不適合分離純化食品和保健品成分。本研究采用的大孔樹脂吸附技術(shù)，只使用乙醇一種有機(jī)溶劑，該溶劑無毒性，適用于保健品和食品成分的分離純化；且大孔樹脂的成本低，可以重復(fù)使用，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

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Study on purifying acteoside from Cistanche tubulosa by macroporous resin

The purpose of this paper was to explore method for purifying acteoside from Cistanche tubulosa by using macroporous resin.The most suitable resin was decided by static tests and then three parameters including eluent concentration，eluting time and eluting rate were optimized for developing dynamic eluting conditions.Results showed that resin HPD300 had the best absorption and desorption capabilities.The content of acteoside increased from 5.26%to 68.20%with recovery of 68.90%under the optimized dynamic eluting conditions——eluting with ultrapure water for 30min after saturation adsorption，then with 20%and 50%ethanol for respectively 75min and 60min with flow rate 10mL/min.The method developed provided a potential approach for industrial production of acteoside from Cistanche tubulosa for its relative high recovery and purity and low cost.

Cistanche tubulosa；acteoside；macroporous resin；purify

TS255.1

B

1002-0306（2015）04-0269-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.050

2014－07－31

顧云（1990-），女，碩士研究生，研究方向：微生物藥物工程與生物技術(shù)。

劉昕（1957-），男，碩士，教授，研究方向：生物技術(shù)。