陳蘭（海南師范大學(xué) ?？?570100）

隨著人民生活水平的提升，對(duì)于化妝品的利用率越來越高，這就為化妝品的質(zhì)量提出了很高的要求，但是現(xiàn)如今在市場(chǎng)中流通的化妝品種類紛繁多樣，品質(zhì)也各不相同，一些化妝品中甚至還有許多對(duì)人類身體有毒有害的化學(xué)成分。這些有毒物質(zhì)本身具有很強(qiáng)的潛伏期，在經(jīng)過使用后會(huì)存在于人體內(nèi)進(jìn)行富集，所以非常不易發(fā)現(xiàn)，隨著近些年來一些因?yàn)E用化妝品導(dǎo)致疾病的事件不斷發(fā)生，人們開始關(guān)注這些有毒物質(zhì)的檢測(cè)，但是傳統(tǒng)的檢測(cè)方法往往針對(duì)具有某一特點(diǎn)的有毒有害物質(zhì)，現(xiàn)在已經(jīng)不能適應(yīng)不斷變異的有毒物質(zhì)檢測(cè)工作，經(jīng)過研究，一種新的檢測(cè)方法——發(fā)光真菌檢測(cè)法被提出來，并具有很好的效果，本文就針對(duì)這種化妝品中有毒物質(zhì)檢測(cè)方法進(jìn)行如下的論述。

1 實(shí)驗(yàn)儀器和藥劑

進(jìn)行該檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用到的化學(xué)藥劑主要有硫酸鐵、亞硫酸鐵、氯金酸、檸檬酸三鈉、濃度為30%的氨水、魯米諾、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、Tris堿、APTES、高純度的氮?dú)?、氯化鈉、對(duì)碘苯酚。應(yīng)用到的儀器為分光光度計(jì)（可見光、紫外線光）、生化培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、發(fā)光檢測(cè)儀、酶標(biāo)儀、振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)。

2 實(shí)驗(yàn)過程

2.1 四氧化三鐵微粒的制備

在制備四氧化三鐵微粒時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用的是化學(xué)沉淀法，將硫酸鐵溶液和亞硫酸鐵溶液按照一定的比例進(jìn)行混合，然后將堿性的沉淀劑加入混合液中，經(jīng)過不斷的攪拌之后放置，一段時(shí)間以后就會(huì)得到納米級(jí)的四氧化三鐵微粒，具有一定的磁性。

反應(yīng)的方程式為：

之后再取10mL的微粒按照水和乙醇1比1的比例配制90mL的混合溶液放入到容量為250mL的圓底燒瓶中，進(jìn)行搖勻，之后再向其中加入300微升的硅烷化試劑盒500微升的氨水，在60攝氏度的條件下向其中通入氮?dú)?，以每分?00轉(zhuǎn)的速度進(jìn)行攪拌，時(shí)間為6小時(shí)。之后將其中的微粒取出，用無水乙醇和蒸餾水進(jìn)行反復(fù)地沖洗，直到?jīng)_洗出的液體中沒有黃色，之后用無水乙醇進(jìn)行定容，測(cè)出其中固體物質(zhì)的含量。

2.2 合成膠體金

進(jìn)行膠體金的合成主要是通過氯金酸在白磷、枸櫞酸鈉、抗壞血酸、鞣酸等物質(zhì)的還原作用下所析出的一種納米級(jí)別的金顆粒。具體的制備方法為：取濃度為0.01%的氯金酸溶液200mL放入四頸瓶中，之后以每分鐘500轉(zhuǎn)的速度于90攝氏度的條件下進(jìn)行預(yù)熱攪拌，時(shí)間大約為5分鐘，之后向其中加入濃度為1%的檸檬酸三鈉適量水溶液直到溶液的顏色不發(fā)生變化，之后通過冷卻回流就能夠制備得到粒徑在20納米左右的膠體金，這種物質(zhì)的外觀是橙紅色的，需要放在棕色瓶中保存。

2.3 制備TP混合抗原

取0.4mL配制好的合成膠體金，撇清其上清液，用0.5mL偶聯(lián)緩沖液對(duì)其進(jìn)行清洗以調(diào)節(jié)pH值的平衡，通過磁性分離撇清其上清液。在磁粒中投加0.5ug/ul的抗原溶液，放于搖床中以每分鐘200轉(zhuǎn)的速度攪拌反應(yīng)30分鐘。通過磁性分離，向磁粒中加入封閉液，放入恒溫振蕩器中以每分鐘200轉(zhuǎn)的速度進(jìn)行攪拌，對(duì)磁粒進(jìn)行封閉，通過磁性分離，撇清其上清液，之后用PBST進(jìn)行3次清洗，將磁粒放于1mLPBS中保存，通過顛倒混合后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 發(fā)光檢測(cè)體系的形成

在每個(gè)反應(yīng)管中個(gè)加入30微升的TP混合抗原、HRP標(biāo)記好的抗原和50pL陽性血清和陰性血清，放入恒溫振蕩器進(jìn)行震蕩30分鐘，溫度為37攝氏度，之后取出進(jìn)行磁性分離，撇清其上清液，用PBST進(jìn)行反復(fù)沖洗，之后再次進(jìn)行磁性分離，撇清其上清液，向其中加入PBS10微升，最后將樣品移到化學(xué)發(fā)光專用的孔板中，分別加入20微升過氧化氫、PIP、Luminol和0.05%的Tween-20，分別放入到發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和分析

3.1 磁微粒的表征

首先需要合成磁微粒，這需要經(jīng)過兩道步驟：首先，需要合成膠體金微粒和四氧化三鐵微粒，具體的方法已經(jīng)在上文中提到，這里不再進(jìn)行贅述，用有機(jī)硅烷這種試劑對(duì)四氧化三鐵微粒進(jìn)行修飾，使微粒的表面附著上-SH這一基團(tuán)；其次，將膠體金微粒和四氧化三鐵微粒進(jìn)行混合反應(yīng)可以得到平均粒徑為3微米左右的磁微粒。磁微粒在制備過程中會(huì)存在四種變化狀態(tài)，具體見圖1。

圖1 磁微粒在制備過程中的變化圖

其中，圖中的A反應(yīng)狀態(tài)為四氧化三鐵的化學(xué)微粒，這是通過化學(xué)沉淀法制得的；圖中的B反應(yīng)狀態(tài)為用有機(jī)硅烷這種試劑對(duì)四氧化三鐵微粒進(jìn)行修飾后的狀態(tài)；圖中的C反應(yīng)狀態(tài)為混合反應(yīng)后生成的磁微粒膠體；圖中的D反應(yīng)狀態(tài)為經(jīng)過沉淀借助于組裝法得到的磁微粒。

由于膠體金于520nm處的可見光區(qū)具有吸收峰，因此把粒徑為20納米左右的膠體金加入到磁微粒中進(jìn)行反應(yīng)，通過紫外光的分光光度計(jì)分別對(duì)膠體金與反應(yīng)合成后的磁微粒分別進(jìn)行吸光度的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖2。

圖2 膠體金和合成磁微粒的吸光度

從圖上可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的提升，520納米處的吸光度越來越小，膠體金也越來越小，其納米粒子都被吸附到了合成磁微粒的表面。此外，在不同的波段、波長處，每個(gè)樣本吸光度都是不同的，以此來進(jìn)行區(qū)分。通過對(duì)比圖上給出曲線的共同點(diǎn)可知，吸光度本身的響應(yīng)曲線非常平坦，只有在特定波長范圍才會(huì)出現(xiàn)峰值，這樣就能夠加以利用實(shí)現(xiàn)光學(xué)的檢測(cè)。

借助于振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)對(duì)合成的磁微粒和四氧化三鐵微粒分別進(jìn)行測(cè)量，可以得到圖3中的磁滯曲線。

圖3 磁滯曲線圖

從圖中可以看出，合成的磁微粒具備很強(qiáng)的超順磁性。

3.2 磁微粒表面發(fā)光體系性能和固定化的分析

磁微粒的表面有大量的膠體金，蛋白分子能夠借助于疏水作用、和磁粒之間的靜電作用以及半胱氨酸的殘基側(cè)鏈所具備的巰基作用將抗原分子固定在磁微粒的表面。使用紫外線分光光度計(jì)對(duì)包被之前的TP抗原和反應(yīng)后的溶液進(jìn)行吸光度的測(cè)定，可以發(fā)現(xiàn)，280納米處TP抗原有著明顯的吸收峰，而反應(yīng)后的溶液在這點(diǎn)之后幾乎沒再出現(xiàn)吸收峰，這就說明抗原幾乎全部都被包在磁微粒的表面。

4 結(jié)語

以上就是基于放光真菌這種測(cè)試方法的整個(gè)流程，這種方法先將化妝品種的有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化成為一種穩(wěn)定檢測(cè)物，因此具有很強(qiáng)的可靠性和準(zhǔn)確性，同時(shí)這種方法也比較簡(jiǎn)單，因此適用于化妝品安全檢測(cè)這一工作。

[1]張華榮,董國富,雷紅宇,等.5種化妝品毒性檢測(cè)方法的應(yīng)用評(píng)估[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2007,10(04).

[2]郭文秀,孫志,云華,等.化妝品毒性檢測(cè)方法新進(jìn)展[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,2012,35(06).