高海娜1 胡 菡 王加啟1 鄭 楠*

(1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農業(yè)部奶產品質量安全風險評估實驗室，北京 100193;2.甘肅農業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070;3.農業(yè)部奶及奶制品質量監(jiān)督檢驗測試中心，北京 100193;4.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

乳蛋白是乳中重要的營養(yǎng)組成成分，具有較高的營養(yǎng)價值，是衡量乳品質高低的重要指標之一［1］。作為可以把吸收的營養(yǎng)物質轉化為乳成分的“生物工廠”—乳腺上皮細胞，是唯一具有分泌功能的細胞，其數量和功能很大程度上決定著乳產量和乳蛋白的合成量［2］。奶牛乳腺上皮細胞主要合成2大類乳蛋白——酪蛋白(80%)和乳清蛋白［3］。

已有的研究表明，探究反芻動物乳腺對氨基酸的吸收代謝模式以及關鍵基因的調控作用，為提高乳腺乳蛋白的產量，改善乳品質提供有效途徑［4－6］。作為奶牛營養(yǎng)物質的氨基酸，不僅可作為蛋白質合成的底物，而且通過刺激哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路中mTOR復合物1影響其下游因子的基因表達和蛋白質磷酸化級聯反應，調節(jié)乳蛋白的合成［7－10］。mTOR是雷帕霉素的靶分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可調節(jié)蛋白質合成、降解和細胞能量代謝等重要的生理功能，在細胞增殖和分化等過程中起著中心調控點的作用［11－13］。其中，這種調節(jié)作用對支鏈氨基酸最為顯著［14－15］。

Mabjeesh等［16］發(fā)現，在奶山羊泌乳早期和晚期，進入乳腺的游離亮氨酸的量大于其合成乳蛋白的量，由此可以推斷亮氨酸在乳腺內除了合成蛋白質之外，還參與了其他的生理過程。Kimball等［17］發(fā)現，亮氨酸對肌蛋白合成是通過mTOR信號通路介導的mRNA翻譯起始而實現的。最近還有研究表明，在乳腺上皮細胞中添加適量的亮氨酸能夠促進乳蛋白的合成［18－19］。但同時也有研究結果指出，組氨酸的添加抑制了mTOR和核糖體S6蛋白激酶(ribosomal protein S6 kinase，S6K1)的磷酸化，使乳蛋白合成減少至65%［19］。因此，推測亮氨酸或組氨酸通過對mTOR信號通路的不同調控作用，最終影響乳蛋白的合成。目前的工作還缺乏對mTOR信號通路中關鍵基因表達研究。

本研究以體外培養(yǎng)的永生化奶牛乳腺上皮細胞(CMECs-H)為模型，利用噻唑藍(MTT)比色法探討不同濃度梯度的亮氨酸或組氨酸添加水平以及培養(yǎng)時間對CMECs-H增殖的影響;同時檢測酪蛋白和mTOR信號通路相關基因的表達。為進一步探索亮氨酸或組氨酸通過mTOR信號通路影響酪蛋白合成機制的重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要儀器

冷凍離心機(索福Legend，德國)、恒溫CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)、倒置顯微鏡(Olympus，日本)、細胞計數儀(Bio-Rad TC10，美國)、RNA 濃度測定儀(Thermo，美國)、凝膠成像系統(tǒng)(Thermo，美國)、IQ5熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)、酶標儀(Thermo，美國)等。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，貨號:11995-065/11765-054)、厄爾平衡溶液(EBSS，北京雷根生物技術有限公司，貨號:CC0043)、胎牛血清(FBS，Gibco，貨號:10099-141)、青鏈霉素(碧云天生物技術研究所，貨號:C0222)、胰酶(碧云天生物技術研究所，貨號:C0203)、L－亮氨酸(Sigma，貨號:L8912-100G)、L －組氨酸(Sigma，貨號:H-5659-25G)、RNA提取試劑盒(TIANGEN，貨號:74106)、反轉錄試劑盒(TaKaRa，貨號:DRR037A)、熒光定量試劑盒(TaKaRa，貨號:DRR820A)、噻唑藍(MTT，Sigma，貨號:0793-5G)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma，貨號:D4540)等。

CMECs-H:以實驗室已經建立的原代奶牛乳腺上皮細胞體系為基礎，采用攜帶SV40大T抗原基因的逆轉錄病毒感染原代奶牛乳腺上皮細胞，經過傳代培養(yǎng)，獲得的一株細胞系。

1.2 試驗方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮永生系細胞培養(yǎng)

實驗室前期已建立奶牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)體系［20］。將 CMECs-H 置于含有 10%FBS的DMEM/F12生長培養(yǎng)基中，在38℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞長滿培養(yǎng)皿(Corning，430165)的90%時，用胰酶溶液于38℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中消化，待細胞質回縮，細胞間隙增大縮成圓形時，用培養(yǎng)基終止消化反應;反復吹打后，收集細胞懸液于離心管，900 r/min室溫離心5 min;棄上清液，加入新鮮的含有 10%FBS的DMEM/F12生長培養(yǎng)基，制成細胞懸浮液。

1.2.2 MTT比色法檢測細胞增殖試驗處理

將細胞密度調整到大約1×105個/mL接種到96孔培養(yǎng)板(Corning，3599)，每孔 100 μL，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12生長培養(yǎng)基貼壁處理24 h，用不含FBS的DMEM/F12生長培養(yǎng)饑餓培養(yǎng)過夜，細胞處理時用EBSS(表1)代替正常培養(yǎng)基。陰性對照組是 EBSS，陽性對照組是EBSS+10%FBS，試驗組是在陰性對照組的基礎上分別補充 0.15、0.45、0.90、1.35、2.70、5.40、10.80、21.60、32.40 mmol/L 9 個濃度的亮氨酸和0.15、0.60、1.20、1.60、2.40、4.80、9.60、14.40、28.80 mmol/L 9個濃度的組氨酸，分別培養(yǎng)12和24 h后進行MTT比色法檢測。最后用全自動酶標儀檢測各孔450 nm波長下的吸光度值(OD450)來判定細胞增殖狀況。細胞相對增殖率(relative growth rate，RGE)計算公式:RGR=試驗組OD450/對照組OD450。每種處理設6個重復，每組試驗重復3次。

表1 厄爾平衡溶液組成Table 1 Composition of the Earle’s balanced salt solution medium

1.2.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測

1.2.3.1 試驗處理

將CMECs-H接種到含有10%FBS的DMEM/F12生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(Thermo 172958)中貼壁處理 24 h，用不含 FBS的DMEM/F12生長培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)過夜，然后對細胞進行6 h的以下處理:陰性對照組(EBSS)，陽性對照組(EBSS+10%FBS)，試驗組分別是在陰性對照組基礎上添加0.45、1.35、5.40、10.80 mmol/L 4 個濃度的亮氨酸和 0.15、1.20、4.80、9.60 mmol/L 4個濃度的組氨酸。每種處理3個重復，每組試驗重復3次。

1.2.3.2 樣品 RNA 提取

處理結束后提取 CMECs-H總 RNA，采用NanoDrop1000檢測RNA純度及260和280 nm波長下的吸光度值的比值(OD260/OD280，OD260/280)，樣品濃度保持在200 ng/μL左右，OD260/280測定值在1.8～2.0，可用于后續(xù)的反轉錄反應。

1.2.3.3 反轉錄

采用500 ng RNA/10μL體系，參照TaKaRa的Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明書進行反轉錄操作。取2μL 5×Prime Script Buffer 2(for Real Time)，0.5 μL Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ，0.5 μL Oligo dT Primer，配制成混合液并混勻后置于冰上，加入2μg模板RNA，再加入RNase-free水補足到10μL，最后將反應體系置于PCR儀上，37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。這樣就得到了cDNA第一鏈，樣品長期保存可放－20℃。

1.2.3.4 qRT-PCR 反應

以 cDNA為模板，參照 TaKaRa的 SYBR Green說明書進行qRT-PCR方法檢測mRNA的表達，選用核糖體(RPS9)基因為內參。試驗中所用的13個基因的引物均由上海生工基因有限公司合成(引物見表2)，其定量反應體系為20μL:10μL SYBRPremix Ex TaqTMⅡ(2 ×)，0.8 μL PCR primer primer，0.8 μL PCR reverse primer，2μL cDNA，6.4μL RNase-free水。反應程序為第1階段95℃ 30 s，1個循環(huán);第2階段退火延伸95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。熔解曲線程序為55℃ 30 s，41個循環(huán)。合成的 cDNA貯存于－20℃冰箱中，備用。利用IQ5實時定量序列檢測軟件(Bio-Rad versa Doc，美國)自動讀取循環(huán)閾 值(Ct值)。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計分析熒光定量數據

采用2－ΔΔCt法分析奶牛乳腺上皮細胞中目的基因mRNA的相對表達量，所有結果用SAS 9.2軟件ANOVA程序進行方差分析，平均值多重比較采用Duncan氏法進行，P＜0.05時表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，結果均以平均值±標準誤表示。qRT-PCR數據統(tǒng)計參見Livak等［26］的方法進行。

2 結果與分析

2.1 亮氨酸或組氨酸對永生化乳腺上皮細胞增殖的影響

由表3和圖1所示，除了亮氨酸濃度為0.15 mmol/L時，在其他添加濃度的條件下，同一濃度不同培養(yǎng)時間對CMECs-H的增殖影響差異不顯著(P＞0.05);而同一時間不同濃度對CMECs-H的增殖有不同程度的影響。其中，當在EBSS中添加0.15～5.40 mmol/L的亮氨酸，培養(yǎng)12 h時，對CMECs-H增殖有顯著促進作用(P＜0.01);而隨著亮氨酸的濃度增大(10.80～32.40 mmol/L)抑制體外培養(yǎng)的 CMECs-H的增殖。

由表4和圖2所示，當添加同一濃度不同培養(yǎng)時間的組氨酸對CMECs-H增殖影響差異不顯著(P＞0.05);而同一時間不同濃度對CMECs-H的增殖有不同程度的影響。其中，當在EBSS溶液中添加0.15～4.80 mmol/L的組氨酸，培養(yǎng) 12和24 h，對CMECs-H有顯著增殖作用(P＜0.05);而隨著組氨酸濃度增大(14.40～28.80 mmol/L)抑制CMECs-H的增殖。培養(yǎng)時間的作用效果如圖2所示，在最適濃度范圍內12 h的增殖作用略微弱于24 h。

表3 亮氨酸對CMECs-H的相對生長率Table 3 Effects of Leu on CMECs-H relative growth rate(n=3)

圖1 亮氨酸對CMECs-H相對生長率的影響Fig.1 Effect of Leu on CMECs-H relative growth rate

2.2 亮氨酸或組氨酸對CMECs-H中酪蛋白相關基因表達量的影響

由表5可見，以體外培養(yǎng)的CMECs-H為模型，在EBSS溶液中添加0.45～10.80 mmol/L范圍的的亮氨酸，與陰性對照組相比，αs1－酪蛋白(αs1-casein，CSN1S1)、αs2－ 酪蛋白(αs2-casein，CSN1S2)和 κ－酪蛋白(κ-casein，CSN3)基因表達均顯著上調(P ＜0.05);β －酪蛋白(β-casein，CSN2)基因表達上調(P=0.054)。這說明亮氨酸能促進乳腺上皮細胞中酪蛋白基因的表達。但是不同濃度水平的亮氨酸對相同酪蛋白的基因促進效果不同。在試驗組中，當亮氨酸的添加濃度為5.40 mmol/L時，CSN1S1和CSN1S2基因表達量最高;而當亮氨酸的添加濃度為1.35 mmol/L時，CSN2基因的表達量最高;而當亮氨酸的添加濃度為0.45 mmol/L時，CSN3基因的表達量最高。

由表6可見，與陰性對照組相比，在EBSS溶液中添加組氨酸顯著影響酪蛋白基因表達量(P＜0.05)。但是隨著組氨酸濃度的升高其基因表達量呈下降趨勢。不同濃度的組氨酸對相同酪蛋白的基因促進效果不同，在試驗組中，當組氨酸的添加濃度為1.20 mmol/L時，CSN1S2和CSN3基因表達量最高;而當組氨酸的添加濃度為0.15 mmol/L時，CSN1S1和 CSN2基因的表達量最高。

2.3 亮氨酸和組氨酸對mTOR信號通路相關基因表達量的影響

由表7可見，與陰性對照組相比，添加亮氨酸上調mTOR復合物1中的mTOR、mTOR復合物1中的綁定蛋白(binds to the kinase domain of mTOR，stabilizes protein of raptor，GβL)、mTOR 調控蛋白(regulatory-associated protein of mTOR，raptor)基因的表達。當亮氨酸的添加濃度為0.45～5.40 mmol/L時，mTOR、raptor和 GβL 基因的表達量顯著升高(P＜0.05)，當亮氨酸的濃度為1.35 mmol/L時，這3個基因的表達量在試驗組中達到最高。但隨著亮氨酸濃度的增加，這3個基因的表達量降低。

表4 組氨酸對CMECs-H的相對生長率Table 4 Effects of His on CMECs-H relative growth rate(n=3)

圖2 組氨酸對CMECs-H相對生長率的影響Fig.2 Effects of His on CMECs-H relative growth rate

當添加亮氨酸時，mTOR信號通路下游基因:S6K1、真核翻譯起始因子4E結合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1)、真核細胞翻譯延伸因子2(eukaryotic elongation factor 2，eEF2)、核糖體蛋白 S6(ribosomal protein S6，rps6)和真核翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，EIF4E)的表達也上調，但添加不同濃度的亮氨酸對mTOR通路中不同下游基因表達的促進效果不同。S6K1基因的表達量隨著亮氨酸濃度的增加而減少;在試驗組中，當亮氨酸的添加濃度為0.45 mmol/L時，S6K1表達量最高;當亮氨酸的添加濃度為1.35 mmol/L時，4EBP1和 eEF2表達量最高;而EIF4E和rps6表達量最高時，亮氨酸的添加濃度為 5.40 mmol/L。

由表8可見，當添加組氨酸時，與陰性對照組相比，raptor、4EBP1、eEF2、EIF4E 和 rps6 基因的表達量隨著組氨酸濃度的增加而增加。在試驗組中，當組氨酸的濃度為4.80 mmol/L時，GβL的表達量達到最高;當組氨酸的濃度為0.15 mmol/L時，mTOR基因的表達量最高;而S6K1基因的表達量最高時，組氨酸的添加濃度為1.20 mmol/L。

3 討論

3.1 亮氨酸或組氨酸對CMECs-H增殖的影響

激素、氨基酸、生長因子等因素影響體外乳腺上皮細胞的增殖、分化、泌乳等功能［27］。本研究在不含FBS的EBSS溶液中單一添加不同濃度的亮氨酸或組氨酸，研究發(fā)現，亮氨酸或組氨酸可以促進CMECs-H增殖，但是隨著濃度的增加細胞增殖率反而下降，這可能與氨基酸過量供應導致利用效率降低有關［28］。龐學艷等［14］研究結果表明，亮氨酸作為外源添加的營養(yǎng)素對奶牛乳腺上皮細胞增殖具有一定的促進作用。同時Mercier等［29］指出，乳腺上皮細胞的數量很大程度上決定乳蛋白的合成量。李喜艷［24］的研究結果表明，當添加不同時間的賴氨酸或蛋氨酸會影響乳腺上皮細胞的增殖。其添加48 h對細胞的增值效果最強，原因是奶牛乳腺上皮細胞對外源添加營養(yǎng)素的適應期需要24 h，隨著時間的延長，細胞生長代謝使得培養(yǎng)基的營養(yǎng)素濃度降低，對原代奶牛乳腺上皮細胞的增殖作用減弱。這與我們的研究結果不一致，本研究結果表明添加時間的不同并不會顯著影響其增殖效果。

表5 亮氨酸氨酸對酪蛋白相關基因表達量的影響Table 5 Effects of Leu on expression amount of genes encoding casein(n=3)

表6 組氨酸氨酸對酪蛋白相關基因表達量的影響Table 6 Effects of His on expression amount of genes encoding casein(n=3)

表7 亮氨酸對mTOR信號通路相關基因表達量的影響Table 7 Effects of Leu on expression amount of genes related to mTOR signaling pathway(n=3)

續(xù)表7

表8 組氨酸對mTOR信號通路相關基因表達量的影響Table 8 Effects of His on expression amount of genes encoding mTOR signaling pathway(n=3)

3.2 亮氨酸或組氨酸對mTOR信號通路介導酪蛋白合成相關基因表達的影響

龐學燕等［14］利用qRT-PCR檢測體外培養(yǎng)乳腺組織中CSN3表達量時發(fā)現，外源補充177.15 mg/L的亮氨酸能夠顯著促進CSN3基因的表達且能夠顯著促進CSN3的合成。有研究表明在乳腺上皮細胞中，必需氨基酸(EAA)通過調節(jié)mTOR信號通路中mTOR、4EBP1、eEF2和rps6因子的磷酸化進而影響乳蛋白合成［30－31］。Toerien等［7］通過對饑餓22 h的泌乳奶牛靜脈灌注氨基酸的研究，其結果表明，乳腺組織中灌注EAA增強了mTOR靶點S6K的磷酸化，同時也促進了乳蛋白的合成，EAA提高或趨向于提高乳腺內mTOR的活性，這表明mTOR信號通路能夠調控乳蛋白產量。這為進一步研究EAA對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白合成的機制提供了依據。

本試驗采用qRT-PCR方法分別檢測單一添加不同濃度的亮氨酸或組氨酸對CMECs-H中乳蛋白相關基因表達。結果表明，在EBSS溶液中添加濃度范圍為0.45～10.80 mmol/L的亮氨酸，與陰性對照組相比，CSN1S1、CSN1S2和CSN3基因表達均顯著上調;CSN2基因表達上調。在EBSS溶液中添加0.15～9.60 mmol/L濃度范圍的組氨酸，與陰性對照組相比，CSN1S1、CSN2和CSN3基因表達均顯著上調。但是不同濃度的亮氨酸和組氨酸對相同酪蛋白相關基因的促進效果不同，當亮氨酸濃度為5.40 mmol/L時，CSN1S1、CSN1S2基因表達量最高;當亮氨酸濃度為1.35 mmol/L時，CSN2基因表達量最高。當亮氨酸濃度為0.45 mmol/L時，CSN3基因表達量最高。這說明當EBSS中亮氨酸添加濃度為0.45～5.40 mmol/L時，酪蛋白相關基因的表達作用較強。這和其他研究者文章中所述的“適宜濃度的氨基酸能夠促進泌乳相關基因的表達”的結果一致［14］。當亮氨酸濃度為5.40 mmol/L時，CSN1S1和CSN1S2基因表達量最高;當組氨酸濃度為0.15 mmol/L時，CSN1S1和CSN2基因表達量最高。這與前人報道的一致［19］。但從結果我們可以看出，無論添加多大濃度的亮氨酸或組氨酸，在影響乳蛋白或與mTOR信號通路相關基因時，基本是EBSS+10%FBS這一組作用最強。這可能是因為FBS中還有細胞生長過程中所需的較全面的蛋白因子及其他一些生物活性物質和營養(yǎng)物質，這也可以說明氨基酸之間的互作作用或是氨基酸與其他營養(yǎng)素之間的互作作用使與泌乳相關基因的表達強于單個氨基酸的作用。

4 結論

EBSS溶液中單一添加亮氨酸的濃度為0.15～5.40 mmol/L，組氨 酸 濃 度 為 0.15 ～9.60 mmol/L范圍時，促進 CMECs-H增殖。隨著濃度的增加，2種氨基酸對CMECs-H的增殖有抑制作用，說明亮氨酸或組氨酸對CMECs-H增殖的影響具有劑量依賴性。同樣，亮氨酸或組氨酸對CMECs-H中酪蛋白的合成也具有劑量依賴性，當亮氨酸或組氨酸在最佳添加范圍，可以調控酪蛋白和mTOR信號通路中與乳蛋白翻譯相關基因的表達，潛在影響乳蛋白的合成。

［1］ 楊金勇.蛋氨酸、賴氨酸及其二肽對奶牛乳腺上皮細胞酪蛋白αs1基因表達的影響［D］.碩士學位論文.杭州:浙江大學，2006:9 －18.

［2］ SINGH K，ERDMAN R A，SWANSON K M，et al.Epigenetic regulation of milk production in dairy cows［J］.Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia，2010，15(1):101 －112.

［3］ 李慶章.奶牛乳腺發(fā)育與泌乳生物學［M］.北京:科學出版社，2014:251－252.

［4］ BRODERICK G A，STEVNSON M J，PATTON R A，et al.Effect of supplementing rumen-protected methionine on production and nitrogen excretion in lactating dairy cows［J］.Journal of Dairy Science，2008，91(3):1092－1102.

［5］ SOCHA M T，PUTNAM D E GARTHWAITE B D，et al.Improving intestinal amino acid supply of pre-and postpartum dairy cows with rumen-protected methionine and lysine［J］.Journal of Dairy Science，2005，88(3):1113－1126.

［6］ 曹洋，艾陽，張源淑.乳蛋白合成的信號通路與營養(yǎng)調控［J］.畜牧與獸醫(yī)，2014，6(7):133 －136.

［7］ TOERIEN C A，TROUT D R，CANT J P.Nutritional stimulation of milk protein yield of cows is associated with changes in phosphorylation of mammary eukaryotic initiation factor 2 and ribosomal s6 kinase 1［J］.The Journal of Nutrition，2010，140(2):285 －292.

［8］ TOERIEN C A，CANT JP.Abundance and phosphorylation state of translation initiation factors in mammary glands of lactating and nonlactating dairy cows［J］.Journal of Dairy Science，2007，90(6):2726 －2734.

［9］ 袁國鋮.不同類型日糧對泌乳奶牛乳腺組織胰島素通路及JAK-STAT信號通路的影響［D］.碩士學位論文.蘭州:甘肅農業(yè)大學，2013.

［10］ GERMAN T，BARASH I.Characterization of an epithelial cell line from bovine mammary gland［J］.In Vitro Cellular ＆ Developmental Biology:Animal，2002，38(5):282 －292.

［11］ 陳洪菊，屈藝，母得志.mTOR信號通路的生物學功能［J］.生命的化學，2010，30(4):555－561.

［12］ DEGUIL J，PERAULT-POCHAT M C，CHAVANT F，et al.Activation of the protein p70S6K via ERK phosphorylation by cholinergic muscarinic receptors stimulation in human neuroblastoma cells and in mice brain［J］.Toxicology Letters，2008，182(1/2/3):91 －96.

［13］ 曾波航，莊瑩，陳靜琦，等.雷帕霉素對肺癌細胞mTOR信號通路相關蛋白表達的作用［J］.腫瘤防治研究，2011，38(10):1105 －1108.

［14］ 龐學燕，季昀，田青，等.亮氨酸對κ－酪蛋白合成的影響及相關信號通路的研究［J］.中國畜牧雜志，2013，49(9):38 －41.

［15］ KIMBALL S R，JEFFERSON L S.New functions for amino acids:effects on gene transcription and translation［J］.The American Journal of Clinical Nutrition，2006，83(2):500S －507S.

［16］ MABJEESH S J，KYLE C E，MACRAE J C，et al.Vascular sources of amino acids for milk protein synthesis in goats at two stages of lactation［J］.Journal of Dairy Science，2002，85(4):919 －929.

［17］ KIMBALL S R，JEFFERSON L S.Signaling pathways and molecular mechanisms through which branched－chain amino acids mediate translational control of protein synthesis［J］.The Journal of Nutrition，2006，136(1S):227S －231S.

［18］ APPUHAMY J A D R N，KNOEBEL N A，NAYANANJALIE W A D，et al.Isoleucine and leucine independently Regulate mTOR signaling and protein synthesis in MAC-T cells and bovine mammary tissue slices［J］.The Journal of Nutrition，2012，142(3):484－491.

［19］ PRIZANT R L，BARASH I.Negative effects of the amino acids lys，his，and thr on s6k1 phosphorylation in mammary epithelial cells［J］.Journal of Cellular Biochemistry，2008，105(4):1038 －1047.

［20］ HU H，WANG JQ，BU D P，et al.In vitro culture and characterization of a mammary epithelial cell line from Chinese Holstein dairy cow［J］.PLoS Ooe，2009，4(11):e7636.

［21］ 徐柏林.精氨酸對乳腺上皮細胞中酪蛋白合成的影響及其調控機制［D］.碩士學位論文.揚州:揚州大學，2012:2－55.

［22］ SIGL T，MEYER H H D，WIEDEMANN S.Gene expression analysis of protein synthesis pathways in bovine mammary epithelial cells purified from milk during lactation and short-term restricted feeding［J］.Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，2014，98(1):84 －95.

［23］ HAYASHI A A，NONES K，ROY N C，et al.Initiation and elongation steps of mRNA translation are involved in the increase in milk protein yield caused by growth hormone administration during lactation［J］.Journal of Dairy Science，2009，92(5):1889 －1899.

［24］ 李喜艷.奶牛乳腺上皮細胞中賴氨酸蛋氨酸配比模式對酪蛋白合成的影響及機理研究［D］.碩士學位論文.北京:中國農業(yè)科學院，2011:1－32.

［25］ 胡菡，王加啟，李發(fā)弟，等.高溫誘導體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞的應激響應［J］.農業(yè)生物技術學報，2011，19(2):287 －293.

［26］ LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2－ΔΔCTmethod［J］.Methods，2001，25(4):402－408.

［27］ EHMANN U K，PETERSON W D，Jr，MISFELDT D S.To grow mouse mammary epithelial cells in culture［J］.Journal of Cell Biology，1984，98(3):1026 －1032.

［28］ RAGGIO G，PACHECO D，BERTHIAUME R，et al.Effect of level of metabolizable protein on splanchnic flux of amino acids in lactating dairy cows［J］.Journal of Dairy Science，2004，87(10):3461 －3472.

［29］ MERCIER JC，GAYE P.Early events in secretion of main milk proteins:occurrence of precursors［J］.Journal of Dairy Science，1982，65(2):299 －316.

［30］ APPUHAMY J A D R，BELL A L，NAYANANJALIE W A D，et al.Essential amino acids regulate both initiation and elongation of mRNA translation independent of insulin in MAC-T cells and bovine mammary tissue slices［J］.The Journal of Nutrition，2011，141(6):1209－1215.

［31］ APELO S I A，SINGER L M，LIN X Y，et al.Isoleucine，leucine，methionine，and threonine effects on mammalian target of rapamycin signaling in mammary tissue［J］.Journal of Dairy Science，2014，97(2):1047－1056.