齊文娟，甄志軍，張志紅

試劑槽貯存酶免試劑對檢測結(jié)果的影響

齊文娟，甄志軍，張志紅

目的：探討尤瑞納斯（Uranus）酶免分析儀試劑槽貯存不同時間的酶聯(lián)免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑對丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）抗體檢測結(jié)果的影響。方法：將抗-HCV試劑采用Uranus試劑槽貯存，分別于0、7、14、21、28 d對HCV系列樣本進行ELISA檢測，并對樣本吸光度（A）值進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果：對于HCV抗體陰性樣本，貯存7 d內(nèi)的檢測結(jié)果較0 d無明顯變化（P＞0.05），自14 d開始，A值逐漸升高（P＜0.05），至21～28 d均顯著高于0 d，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而對于HCV抗體弱陽性及陽性樣本，自14 d開始，檢測A值均顯著低于0 d（P＜0.01）。結(jié)論：抗-HCV試劑以試劑槽貯存至14 d對ELISA檢測結(jié)果有明顯影響，甚至導致弱陽性樣本的漏檢。應每7 d清洗試劑槽1次，并及時更換試劑。

貯存試劑；酶聯(lián)免疫吸附測定；丙型肝炎病毒

0 引言

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是國家規(guī)定的獻血者篩查項目之一，間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是HCV抗體篩查的常用方法[1]，尤瑞納斯（Uranus）全自動酶免分析系統(tǒng)（以下簡稱“Uranus”）以高效率、循環(huán)進樣、直觀、易操作等優(yōu)點用于ELISA檢測，很大程度上提高了血液檢測的質(zhì)量[2]，已普遍用于獻血者篩查項目的ELISA檢測。我站于2011年引進U-ranus AE280，廠家建議試驗后將剩余酶免試劑以試劑槽4℃貯存，但對于有效貯存期限未給出明確的指導意見。以往研究報道[3-4]，酶免試劑貯存不當會使試劑檢測靈敏度下降，最終導致結(jié)果失控。為了探討試劑槽貯存酶免試劑對檢測結(jié)果的影響，我們將血站用于獻血者HCV抗體檢測的酶免試劑以Uranus試劑槽貯存，對不同確定結(jié)果的系列樣本進行ELISA檢測，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗樣本

收集2012年11月至2013年11月無償獻血者血液樣本，經(jīng)2家HCV試劑盒檢測，陰性樣本20例，弱陽性樣本（樣本值/臨界值（S/CO值）1～5）20例，陽性樣本（S/CO值≥10）10例。其中，男39例，女11例。所有樣本均無溶血、乳糜、黃疸，3 200 r/min離心15 min，分離血漿后，小心吸取上層血漿于新的Eppendorf管內(nèi)，每管200 μL，每例樣本共分裝5管，置-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

抗-HCV ELISA診斷試劑盒（國產(chǎn)某公司，批號：C20130508），經(jīng)中國藥品生物制品檢定所批檢合格；抗-HCV室內(nèi)質(zhì)控品，北京康徹思坦有限公司，批號為201303001，濃度為1 NCU/mL。所有試劑使用前經(jīng)過確認，均在有效期內(nèi)。

1.3 主要儀器

Uranus AE280全自動酶免分析系統(tǒng)（深圳愛康電子有限公司），臺式普通高速離心機（德國TECAN公司）。

1.4 方法

1.4.1 試劑準備

將裝有HCV抗體的ELISA試劑盒由4℃冰箱取出，平衡至室溫（13～25℃），將HCV抗體試劑盒內(nèi)樣本稀釋液、酶結(jié)合物、底物A、底物B、終止液分別倒入相應的Uranus試劑槽中，并放在相應的位置。

1.4.2 樣本準備

取50例凍存的系列HCV樣本，包括20例HCV陰性樣本、20例HCV弱陽性樣本、10例HCV陽性樣本，將樣本血漿于室溫復融，并平衡至室溫，實驗前混勻。

1.4.3 實驗

實驗步驟嚴格按試劑說明書，設定空白對照、陰性對照、陽性對照、弱陽性室內(nèi)質(zhì)控孔，將系列HCV樣本進行ELISA雙孔檢測，作為對照組（0 d）。在Uranus全自動酶免分析系統(tǒng)中進行稀釋、加樣、溫育、洗板、讀數(shù)，剩余試劑用Uranus試劑槽貯存置于4℃冰箱中，期間模擬日常實驗時間將試劑槽取出于室溫放置，并依次于7、14、21、28 d的同一時間分別取50例系列HCV樣本進行ELISA雙孔檢測，實驗均由同一操作人完成。

1.4.4 結(jié)果判斷

取雙孔的平均吸光度（A）值，S/CO值≥1.0判為陽性，＜1.0判為陰性。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料均以“均數(shù)±標準差（±s）”表示，并進行正態(tài)分布及方差齊性檢驗，2組間的比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

不同貯存時間的試劑槽貯存試劑對HCV抗體檢測A值的影響（±s）見表1。

表1 不同貯存時間的試劑槽貯存試劑對HCV抗體檢測A值的影響（±s）

表1 不同貯存時間的試劑槽貯存試劑對HCV抗體檢測A值的影響（±s）

注：*與0 d的比較，P＜0.05，有顯著差異；**與0 d的比較，P＜0.01，有極顯著差異

貯存時間/d HCV陰性 HCV弱陽性 HCV陽性00 0.007 6±0.001 7 0.430 4±0.057 4 3.021 3±0.555 5 07 0.007 4±0.001 3 0.429 6±0.055 3 3.068 6±0.502 4 14 0.008 9±0.003 6** 0.417 8±0.048 8** 2.801 9±0.445 3**21 0.021 7±0.005 8** 0.306 1±0.041 7** 2.155 9±0.424 0**28 0.056 3±0.072 6** 0.104 1±0.012 2** 1.040 2±0.309 5**

由表1可見，雖然所有HCV系列樣本以7 d內(nèi)的貯存試劑檢測，結(jié)果較0 d無明顯變化（P＞0.05），但自14 d后試劑槽貯存試劑對HCV抗體樣本的檢測A值的影響顯著：20例HCV抗體陰性樣本，自14d開始，A值逐漸升高（P＜0.05），及至21 d均顯著高于0 d，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；貯存試劑對弱陽性及陽性血液樣本檢測結(jié)果的影響更顯著，20例HCV抗體弱陽性樣本及10例陽性樣本的檢測結(jié)果顯示：自14 d開始，檢測樣本的A值隨試劑貯存時間的延長逐漸降低，均顯著低于0 d，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

3 討論

丙型肝炎是世界各國及地區(qū)共同面臨的嚴重傳染病，特別是經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)。HCV是造成輸血后肝炎的主要病因，經(jīng)血傳播是HCV傳播的主要途徑。全球已有1.17億人受到感染，我國有感染者大約4 000萬，有相當一部分慢性丙肝感染者會發(fā)展成肝硬化、肝癌，給家庭和社會造成沉重的經(jīng)濟負擔[5-7]。因此，嚴把獻血者丙肝病毒感染檢測質(zhì)量關，是切斷輸血傳播丙型肝炎、保證臨床用血安全的關鍵。

目前，ELISA法測抗-HCV是我國大多采供血機構(gòu)用于獻血員篩查丙肝病毒傳染指標的最主要方法[8]。根據(jù)《血站質(zhì)量規(guī)范》和《血站試驗室質(zhì)量管理規(guī)范》的規(guī)定，為了保證檢測結(jié)果的可靠性，使酶免設備正常、高效地運行，要求對設備建立和實施維護、校準以及持續(xù)監(jiān)控等管理制度，針對設備的性能，制定完善而有層次的維護保養(yǎng)方案，對設備定期實施不同層面的維護保養(yǎng)[9]。本研究旨在通過探究酶免試劑的試劑槽貯存時間對于獻血者HCV抗體ELISA檢測結(jié)果的影響，明確實驗室對Uranus全自動酶免分析儀試劑槽的維護要求，為實驗室優(yōu)化設備維護程序提供數(shù)據(jù)支持。

研究顯示，國產(chǎn)抗-HCV試劑可以用Uranus試劑槽貯存7 d而不影響陰性樣本測定，自貯存14 d開始，血液樣本的A值逐漸增高，直至28 d檢測結(jié)果幾乎接近“灰區(qū)”值（0.071～0.140），這表明試劑槽貯存試劑時間越長，其HCV檢測的假陽性率將越高，一定程度上使假陽性樣本增加，血液報廢率提高，導致寶貴的血液資源浪費。陰性樣本產(chǎn)生非特異性顯色的原因可能與試劑槽貯存的樣本稀釋液有關。樣本稀釋液一般由磷酸鹽緩沖液、牛血清白蛋白以及試劑穩(wěn)定劑等組成，其可以保證血漿樣本最合適的ELISA反應環(huán)境及微量血漿樣本與聚乙烯包被孔接觸面積大小的一致性。良好的樣品稀釋液可有效降低非特異性反應，提高ELISA檢測方法的敏感性和特異性，保證ELISA檢測結(jié)果的準確[10]。在HCV試劑說明書中，寫明樣本稀釋液不宜長時間暴露于空氣中，每次使用樣本稀釋液后應盡快蓋好瓶蓋，否則會影響實驗結(jié)果。試劑槽貯存的樣品稀釋液長時間暴露于一般環(huán)境中，隨著貯存時間的延長，試劑穩(wěn)定劑中的氨基酸、糖類等有機物易受到空氣的氧化，可能會導致稀釋液pH的改變以及試劑中蛋白成分的變性，在ELISA檢測中不能發(fā)揮應有的作用，產(chǎn)生非特異性反應。另外，底物B對光敏感，底物溶液用試劑槽貯存一定時間后易變藍，使ELISA板底增高，影響測定結(jié)果。

特別值得關注的是，當以試劑槽貯存試劑檢測HCV抗體弱陽性和陽性樣本時，自貯存的14 d開始，樣本的A值隨著貯存時間的延長逐漸降低，特別是28 d后的弱陽性樣本A值低于臨界值（0.140），這樣對處于臨界值水平的HCV樣本，增加結(jié)果判斷難度，稍有不慎，使樣本的檢測結(jié)果發(fā)生質(zhì)的改變，導致弱陽性樣本的漏檢。這也表明試劑槽貯存的酶免試劑對弱陽性、陽性樣本的檢測結(jié)果仍有較大影響。對于此結(jié)果，研究者認為可能由以下原因造成：一方面，在血站每個批次的樣本檢測中，從試劑平衡至室溫到實驗結(jié)束放回4℃冰箱，每次實驗試劑槽內(nèi)的試劑在室溫中的暴露時間為4～5 h，而且實驗后只在試劑槽上加蓋一個自制的塑料蓋便放入4℃冰箱貯存。酶結(jié)合物經(jīng)反復使用，使貯存溫度不恒定，極易使酶的催化活性和抗體的免疫活性降低。另一方面，底物A易揮發(fā)，試劑槽內(nèi)的貯存試劑長時間暴露于空氣中，可引起底物A的濃度變化及底物B的分解。底物A的濃度過低或過高都會抑制酶促反應[11]，造成試劑盒的底物敏感度和穩(wěn)定性降低，一定條件下可引起弱陽性和陽性樣本A值降低，從而導致接近臨界值樣本出現(xiàn)假陰性，以致陽性樣本的漏檢，由此可能造成HCV通過輸血途徑傳播的嚴重后果。

綜上所述，用Uranus試劑槽貯存7 d內(nèi)HCV抗體試劑對于ELISA檢測結(jié)果并無影響。然而酶免試劑在經(jīng)過試劑槽貯存過程中會受到各種因素（如空氣、溫度、振蕩等）的影響，其試劑質(zhì)量會發(fā)生不同程度的變化，試劑盒內(nèi)任何一種組分不穩(wěn)定都會導致酶免檢測結(jié)果產(chǎn)生誤差，特別是酶結(jié)合物、底物等。因此，對全自動酶免分析儀的試劑槽應進行周期性、多層次的維護保養(yǎng)[12]。一般進口酶免分析儀的試劑槽配置為消耗性器材，采用1周更換1次的方法對試劑槽進行維護[13-15]，而Uranus全自動酶免分析儀的試劑槽為廠家固定配置器材，因此為了確保酶免試劑在獻血員血液篩檢中的高質(zhì)量使用，首先建立試劑槽維護和持續(xù)監(jiān)控等管理制度，并將維護保養(yǎng)方案寫入實驗室質(zhì)量管理手冊。其次，切實實施試劑槽周維護制度，每周對Uranus試劑槽進行1次一般維護，徹底清洗后，浸泡30 min后用純水沖洗干凈，將試劑槽倒扣于吸水紙上，實驗前更換新試劑；每次維護時用棉簽徹底清潔試劑槽內(nèi)壁，特別是Uranus試劑槽為棕色壁，試劑變色不易察覺，如觀察擦拭后的棉簽上有藍色或其他雜質(zhì)，說明該試劑槽中的試劑組分已變質(zhì)或已受污染，應用純水浸泡過夜后徹底清洗干凈，并用紫外線照射消毒；每天使用前應觀察槽中的試劑是否變色、渾濁等，如試劑外觀發(fā)生改變，立即按以上針對試劑槽污染程序的維護操作對其進行處理，實驗換用備用的試劑槽。根據(jù)實驗需要估計試劑用量，盡量減少試劑剩余量；使用后應及時加蓋相應的試劑槽蓋子并將試劑槽放人4℃冰箱貯存，并監(jiān)測和記錄冰箱溫度，防止溫度或其他因素對酶免試劑的質(zhì)量造成影響[16]，避免試劑槽貯存試劑帶來的系統(tǒng)誤差，保證檢驗結(jié)果的準確，確保臨床用血安全。本實驗為模擬實驗，設計還不夠完善，采用的血液樣本數(shù)量及選取的時間點偏少，研究結(jié)果有待于進一步驗證。

[1]李妙羨，王香玲，吳曉康，等.HCV抗原檢測與HCV-RNA和HCV抗體檢測的比較研究[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2012，27（4）：55-57.

[2]李鵬，聶心教.UranusAE200全自動酶免分析儀分析性能的確認[J].中國輸血雜志，2011，24（11）：982-984.

[3]桑列勇.酶結(jié)合物效價下降引起抗—HCV檢測失控原因分析[J].臨床輸血與檢驗，2003，5（2）：126-127.

[4]梁俊杰，肖瑋，劉樂霞，等.運輸溫度對酶免試劑質(zhì)量影響分析[J].河北醫(yī)藥，2012，41（16）：2 526-2 527.

[5]Alter M J.Epidemiology of hepatitis C virus infection[J].World J Gastroenterol，2007，13（17）：2 436-2 441.

[6]Lavanchy D.The global burden of hepatitis C[J].Liver Int，2009，29（Suppl 1）：74-81.

[7]中華醫(yī)學會肝病學分會和中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會.丙型肝炎防治指南[J].實用肝臟病雜志，2004，25（5）：369-375.

[8]邢培清，劉玉振.實用輸血檢驗[M].鄭州：鄭州大學出版社，2001：78-83.

[9]張瑤嬋，張泳.設備確認存在的問題及分析[J].中國輸血雜志，2010，23（11）：909-910.

[10]DU Gai-mei，LIU Mao-jun，GAN Yuan，et al.Study on screening of optimal blocking buffer and sample diluent for ELISA[J].Agricultural Science&Technology，2013，14（6）：815-819，837.

[11]李紅梅，陳佳，徐斐，等.ELISA測定中TMB顯色體系的優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究[J].生物技術(shù)通報，2010，26（2）：126-130.

[12]高東英.采供血機構(gòu)體外免疫診斷試劑評價系統(tǒng)的初步探討[J].中國輸血雜志，1999，12（1）：56-57.

[13]武峰.Microlab FAME全自動酶免分析系統(tǒng)常見故障及排除方法[J].中國醫(yī)學裝備，2007，9（10）：49-50.

[14]戴云，許雷，馮秋霞.全自動酶免分析儀FAME的保養(yǎng)及常見故障排除[J].醫(yī)療衛(wèi)生裝備，2012，33（3）：140，142.

[15]鄭允福，金蓮花，趙仁玉，等.Microlab FAME全自動酶免分析儀的日常維護、保養(yǎng)及常見故障分析和處理[J].醫(yī)學信息，2012，25（8）：145-146.

[16]高均翠.抗-HCV ELISA檢測試劑質(zhì)量抽檢分析[J].中國輸血雜志，2011，24（6）：512-514.

（收稿：2014-03-06 修回：2014-06-11）

Influence of reagents stored in tank on ELISA results

QI Wen-juan,ZHEN Zhi-jun,ZHANG Zhi-hong
（Blood Center of Xingtai,Xingtai 054000,Hebei Province,China）

ObjectiveTo discuss the influences of reagents storage time in Uranus tank on ELISA results for HCV detec tion.MethodsAnti-HCV reagents were stored in Uranus tank,and then underwent ELISA detection 0,7,14,21 and 28 d after,and the absorbance(A)values were analyzed statistically.ResultsThe negative reagents to HCV antibody had A values 7 d after with no significant difference with those of 0 d(P＞0.05),and increased gradually 14 d after(P＜0.05), and significantly higher than those of 0 d(P＜0.01).The positive and weakly positive samples had A values significantly lower 14 d after than those of 0 d(P＜0.01).Conclusion It′s proved that 14 d reagent storage in Uranus tank may obviously influence the ELISA results and may even result in missed detection of weakly positive samples.The tank has to be cleaned once a week,and the reagents have to be replaced timely.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（1）：87-89]

storage reagent;enzyme-linked immunosorbent assay;hepatitis C virus

R318.6；TH776

A

1003-8868（2015）01-0087-03

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.01.087

邢臺市科技支撐項目（2012ZC170）

齊文娟（1976—），女，主管技師，主要從事輸血檢驗方面的研究工作，E-mail：qiwenjuan2002@163.com。

054000河北邢臺，邢臺市中心血站（齊文娟，甄志軍，張志紅）