吳 旋汪 欣陳云歡蔡梅玉程 穎

補(bǔ)陽還五湯對腦缺血大鼠血清TNF-ɑ、IL-6、CRP的影響研究*

吳 旋①汪 欣①陳云歡①蔡梅玉①程 穎①

目的：探討補(bǔ)陽還五湯對MCAO（大腦中動(dòng)脈線栓法）大鼠血清TNF-ɑ、IL-6、CRP的影響。方法：60只大鼠隨機(jī)分為四組：假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽還五湯低劑量組、補(bǔ)陽還五湯高劑量組。Garcia JH評分標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)受試大鼠的神經(jīng)功能，化學(xué)發(fā)光法檢測大鼠外周血清TNF-a、IL-6的水平，免疫比濁法檢測大鼠血清CRP水平。結(jié)果：術(shù)后第7天，補(bǔ)陽還五湯低劑量組和高劑量組大鼠神經(jīng)功能得到一定程度的恢復(fù)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)低劑量組和高劑量組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。補(bǔ)陽還五湯低劑量組、高劑量組的TNF-a與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量組的IL-6、CRP與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高劑量組的IL-6、CRP與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：補(bǔ)陽還五湯可下調(diào)MCAO大鼠TNF-a、IL-6、CRP水平，通過減輕炎癥作用，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用。

補(bǔ)陽還五湯； 神經(jīng)功能； 炎癥因子

腦缺血是臨床上心腦血管的多發(fā)病，具有較高的致殘率和致死率，如何在發(fā)病早期予以早期干預(yù)是目前臨床面臨的一個(gè)重要難題。補(bǔ)陽還五湯出自清代王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》，是臨床上治療腦缺血的重要方劑，然而其作用機(jī)制仍不明確。為深入探討其機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用大腦中動(dòng)脈線栓法（MCAO）建立大鼠腦缺血模型，采用補(bǔ)陽還五湯進(jìn)行灌胃治療，觀察補(bǔ)陽還五湯對MCAO大鼠外周血炎癥指標(biāo)TNF-ɑ、IL-6、CRP的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級成年Wistar大鼠60只，雄性，100～150 g，購自福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。大鼠在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，待體重達(dá)到250～300 g開始進(jìn)行干預(yù)、造模等工作。60只大鼠隨機(jī)分成四組：（1）假手術(shù)組：15只，假手術(shù)后，常規(guī)飼養(yǎng)于籠內(nèi)，不進(jìn)行任何干預(yù)治療；（2）模型組：15只，造模后常規(guī)飼養(yǎng)于籠內(nèi)，不進(jìn)行任何干預(yù)治療；（3）補(bǔ)陽還五湯低劑量組：15只，5 g/（kg·只）（按體表面積算相當(dāng)于成人等效劑量），1次/d，造模前灌胃7 d，造模后繼續(xù)灌胃7 d。（4）補(bǔ)陽還五湯高劑量組：15只，25 g/（kg·只）（按體表面積算相當(dāng)于成人等效劑量的5倍），1次/d，造模前灌胃7 d，造模后繼續(xù)灌胃7 d。

1.2 補(bǔ)陽還五湯制備 補(bǔ)陽還五湯各單味藥購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司，嚴(yán)遵照原方配比而成，含生黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，赤芍4.5 g，地龍3 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g。中藥飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照《中國藥典》2010年版。按2006年7版《中藥藥理研究學(xué)》制備補(bǔ)陽還五湯水煎液，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)醫(yī)院藥劑科完成：加水500 mL浸泡30 min，武火煎煮沸騰后改用文火加熱30 min收取1次藥液，再加水500 mL煎煮，方法同前，去藥渣后用濾紙過濾，將2液混合加熱濃縮，使生物藥濃度為1.2 g/mL，置于4 ℃下冷藏備用。

1.3 動(dòng)物模型制備 術(shù)前禁食12 h，用3.4％水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，參照文獻(xiàn)[1]，采用改良線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型：頸部正中切開皮膚及淺筋膜，鈍性分離右側(cè)胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌之間的肌間隙，掀起右側(cè)胸骨舌骨肌的外側(cè)緣，即可見內(nèi)下方的頸總動(dòng)脈（CCA）與迷走神經(jīng)?？焖儆坞xCCA，在距頸動(dòng)脈分叉約5 mm處近心端結(jié)扎，并在結(jié)扎處和頸動(dòng)脈分叉之間備一根縫合線，打單結(jié)，輕輕牽拉此縫合線以暴露周圍血管神經(jīng)，邊分離CCA，邊牽拉縫合線向上滑行，直至CCA、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）和枕動(dòng)脈與周圍組織游離。緊靠頸動(dòng)脈分又處結(jié)扎ECA和枕動(dòng)脈，在ICA穿線打活結(jié)暫時(shí)阻斷ICA血流。在CCA結(jié)扎處和其上端備線處之間剪一小口，用制備好的栓線沿CCA插入ICA，此時(shí)適度扎緊CCA備用的縫合線，以阻斷ICA血液流出為宜，同時(shí)松開ICA的結(jié)扎線，繼續(xù)沿ICA推進(jìn)栓線，當(dāng)感到有阻力時(shí)，停止進(jìn)線，此時(shí)栓線即到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始處，扎緊CCA的縫合線，以防止其內(nèi)的線栓移動(dòng)和出血。最后剪除多余的栓線，分層縫合切口。注意避免損傷迷走神經(jīng)。在插線的過程中要注意手感，當(dāng)遇到阻力時(shí)，不要用蠻勁插入，手法要輕柔、迅速，按照動(dòng)物的體重和營養(yǎng)選擇適當(dāng)?shù)乃ň€。術(shù)后2 h對大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評價(jià)。以Longa 5級4分法評價(jià)模型的有效型。術(shù)后2 h和術(shù)后7 d分別采用Garcia JH評分標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)受試大鼠運(yùn)神經(jīng)功能。

1.4 大鼠外周血TNF-a、IL-6、CRP檢測 造模后7 d處死大鼠，從腹主動(dòng)脈采集動(dòng)脈血5 mL，3500轉(zhuǎn)離心30 min后取血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用化學(xué)發(fā)光法檢測血清TNF-a、IL-6，采用免疫比濁法檢測血清CRP。檢測儀器：西門子DPC Immulite全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀和日立7180全自動(dòng)生化分析儀，儀器當(dāng)天相關(guān)質(zhì)控在控。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)陽還五湯對MCAO大鼠神經(jīng)功能的影響 術(shù)后第7天，補(bǔ)陽還五湯低劑量組和高劑量組大鼠神經(jīng)功能得到一定程度的恢復(fù)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)低劑量組和高劑量組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 補(bǔ)陽還五湯對大鼠血清TNF-a、IL-6、CRP的檢測結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低劑量組、高劑量組的TNF-a與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量組的IL-6、CRP與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高劑量組的IL-6、CRP與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 補(bǔ)陽還五湯對大鼠神經(jīng)功能評分的影響（±s） 分

表1 補(bǔ)陽還五湯對大鼠神經(jīng)功能評分的影響（±s） 分

*與假手術(shù)組比較，P＜0.05；△與模型組比較，P＜0.05；#與低劑量組比較，P＜0.05

組別術(shù)后2 h術(shù)后7 d假手術(shù)組（n=15）18.0±0.018.0±0.0模型組（n=15） 7.8±0.8*8.4±1.0*低劑量組（n=15） 8.4±0.6 10.8±1.1△高劑量組（n=15） 9.0±0.9 12.5±1.3△#

表2 補(bǔ)陽還五湯對大鼠血清TNF-a、IL-6、CRP的影響（±s）

表2 補(bǔ)陽還五湯對大鼠血清TNF-a、IL-6、CRP的影響（±s）

*與模型組組比較，P＜0.05

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3 討論

補(bǔ)陽還五湯出自清代王清任著《醫(yī)林改錯(cuò)》一書，由黃芪、赤芍、川芎、當(dāng)歸、地龍、桃仁、紅花七藥組成，針對氣虛血瘀型中風(fēng)后遺癥而設(shè)[2]。方中重用黃芪，少佐活血化瘀之品，諸藥合用，使氣旺血行、瘀祛絡(luò)通[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，補(bǔ)陽還五湯具有擴(kuò)張血管、增加腦血流量、改善微循環(huán)、降低血液黏滯性、抗血小板聚集、抗血栓、對抗腦缺血后腦組織損傷等多種途徑發(fā)揮臨床作用[4-6]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCAO大鼠經(jīng)補(bǔ)陽還五湯灌胃治療后，神經(jīng)損傷得到一定程度的恢復(fù)（P＜0.05），并且與藥物劑量密切相關(guān)（P＜0.05）。腫瘤壞死因子TNF-a，主要由單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等分泌，是體內(nèi)重要的炎癥因子，具有多重生物功能，其對血管炎性反應(yīng)過程的具有調(diào)節(jié)和促進(jìn)生長的作用[7-8]。IL-6是白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞激活的關(guān)鍵，其在動(dòng)脈粥樣硬化血管壁中的濃度為其血清濃度的200倍，同時(shí)其可使血管平滑肌增生，促進(jìn)動(dòng)脈硬化進(jìn)展及斑塊由穩(wěn)定向不穩(wěn)定發(fā)展[9-10]，另外IL-6激活的白細(xì)胞可誘導(dǎo)大量細(xì)胞黏附，導(dǎo)致微血管堵塞，加重腦損傷，并與腦卒中后功能康復(fù)及腦梗死體積密切相關(guān)[11-12]。CRP是機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)時(shí)合成的急性期反應(yīng)蛋白，在機(jī)體對炎癥、組織損傷、感染等反應(yīng)中起著重要作用。CRP不僅是心血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，而且可精確、敏感地反映粥樣硬化斑塊炎癥反應(yīng)程度，與患者腦梗死面積大小及意識障礙水平相關(guān)[13-15]。

本實(shí)驗(yàn)中MCAO大鼠術(shù)后第7天，采集大鼠外周血，觀察MCAO大鼠外周血相關(guān)炎癥指標(biāo)TNF-a、 IL-6、CRP。結(jié)果顯示補(bǔ)陽還五湯（無論低劑量或高劑量）干預(yù)后，TNF-a均出現(xiàn)不同程度下降（P＜0.05），IL-6、CRP在高劑量組下降明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示補(bǔ)陽還五湯可下調(diào)MCAO大鼠TNF-a、IL-6、CRP水平，通過減輕炎癥作用，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用，從實(shí)驗(yàn)室的角度進(jìn)一步證實(shí)了補(bǔ)陽還五湯的功效。然而作為一個(gè)經(jīng)方，補(bǔ)陽還五湯的作用還未十分明了，其中對細(xì)胞凋亡的調(diào)控將是未來本課題組研究的重要方向。

致謝：實(shí)驗(yàn)平臺，福建省康復(fù)技術(shù)工程研究中心。

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Influence of Buyanghuanwu Decoction on the Expression of TNF-ɑ，IL-6，CRP in Cerebral Ischemia Rats/

WU Xuan， WANG Xin，CHEN Yun-huan，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（12）：030-032

Objective：To discuss the influence of Buyanghuanwu decoction on the expression of TNF-ɑ，IL-6，CRP in MCAO rats.Method：60 rats were divided into four groups：control group， model group，low-dose of Buyanghuanwu decoction group and high-dose of Buyanghuanwu decoction group.Motor nerve function of rat was evaluated by using Garcia JH score ，serum TNF-ɑ，IL-6 were detected by using bioluminescence and serum CRP were detected by using immunoturbidimetry.Result：7 days after surgery，compared with model group， nerve function of rats recovered in low-dose group and high-dose group，with significant difference（P＜0.05）.There was significant difference betweenlow-dose group and high-dose group（P＜0.05）.Compared with model group，there was significant difference of TNF-ɑ in low-dose group and high-dose group（P＜0.05）.Compared with model group，there was no difference of IL-6，CRP in low-dose group（P＞0.05） ，with significant difference in high-dose group（P＜0.05） .Conclusion：In order to protect nerve function，Buyanghuanwu decoction can reduce TNF-ɑ，IL-6，CRP and relieve inflammation.

Buyanghuanwu decoction； Nerve function； Inflammation factor

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.12.009

2014-10-27） （本文編輯：蔡元元）

福建中醫(yī)藥大學(xué)重點(diǎn)學(xué)科（腦血管疾病康復(fù)的基礎(chǔ)和臨床研究）專項(xiàng)校管課題（X2014076-學(xué)科）；福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（科技B類）（JB14056）；福建省衛(wèi)生計(jì)生委青年科研課題（2014-2-37）

①福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院 福建 福州 350003

汪欣

First-author’s address：Rehabilitation Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350003，China