王曉紅，譚曉風(fēng)，胡芳名，楊 偉

（中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

PP333對(duì)非洲菊試管叢生芽離體低溫保存的影響

王曉紅，譚曉風(fēng)，胡芳名，楊 偉

（中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

為了延長(zhǎng)非洲菊離體低溫保存周期，以非洲菊Gerbera jamesoniiBolus的試管叢生芽為材料，研究生長(zhǎng)延緩劑PP333的質(zhì)量濃度和保存時(shí)間對(duì)非洲菊離體低溫保存的影響。結(jié)果表明：低溫結(jié)合PP333的使用對(duì)非洲菊叢生芽的生長(zhǎng)有顯著影響，PP333質(zhì)量濃度與叢生芽高度、增殖系數(shù)、黃化率呈顯著的負(fù)相關(guān)，與褐化率呈顯著的正相關(guān)。離體保存時(shí)間延長(zhǎng)，黃化率顯著提高，以低溫保存6個(gè)月后取出復(fù)壯1次為宜。在MS＋6-BA 0.5mg/L的培養(yǎng)基中添加1.0mg/L的PP333，在低溫12 ℃離體保存效果最佳。

非洲菊；生長(zhǎng)延緩劑PP333；組織培養(yǎng)；離體低溫保存

非洲菊Gerbera jamesoniiBolus別名扶郎花，菊科扶郎花屬多年生宿根草本花卉，原產(chǎn)南非。其花朵碩大，花色豐富艷麗，花枝粗壯挺拔，切花保鮮期長(zhǎng)，具有很高的觀賞價(jià)值，是世界十大切花之一[1]。在溫室條件下周年開花，既可作盆栽觀賞又可作切花生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值可觀，商業(yè)價(jià)值高，是目前國(guó)際花卉市場(chǎng)上常見的花卉。切花非洲菊已具有很大的市場(chǎng)[2]，盆花非洲菊也將具有很大的發(fā)展?jié)摿3]。

非洲菊在長(zhǎng)期高頻率的繼代過程中，產(chǎn)生大量變異，不利于保持品種的優(yōu)良性狀。而且非洲菊的試管苗生長(zhǎng)快，在常溫下保存則每個(gè)月就需繼代1次，繁瑣耗時(shí)，浪費(fèi)人力物力。為了探索一條既可延長(zhǎng)繼代時(shí)間又能保持品種優(yōu)良特性的種質(zhì)保存途徑，本試驗(yàn)中通過在培養(yǎng)基中加入適量的生長(zhǎng)延緩劑PP333，在低溫下進(jìn)行非洲菊試管苗的種質(zhì)保存，研究PP333的質(zhì)量濃度和保存時(shí)間對(duì)非洲菊離體低溫保存的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

以非洲菊‘Festival’品種的離體快速繁殖的叢生芽為植物材料。

1.2 方 法

1.2.1 離體保存條件與方法

取健壯均勻的叢生芽切單芽后接種在含有培養(yǎng)基的無(wú)菌瓶中。培養(yǎng)基為MS＋0.5mg/L 6-BA＋PP333，PP333設(shè)5個(gè)水平，分別是0、0.5、1.0、2.0、5.0mg/L。在恒溫光照箱內(nèi)進(jìn)行離體培養(yǎng)和保存，設(shè)置低溫12 ℃，光強(qiáng)300 lx，光周期12 h。低溫保存時(shí)間設(shè)3個(gè)水平，分別為3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月。每個(gè)組合接種30瓶，重復(fù)3次。

1.2.2 離體保存植株生長(zhǎng)與指標(biāo)測(cè)定

離體培養(yǎng)的第3、6、9個(gè)月后分別統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)、叢生芽高度、葉片黃化率、褐化率4個(gè)指標(biāo)，測(cè)定保存6個(gè)月后的叢生芽葉綠素含量。葉綠素含量的測(cè)定采用分光光度法。先稱取葉片鮮質(zhì)量0.2 g，每樣品各3份，剪碎后，放入10 mL離心管中，加5 mL丙酮和無(wú)水酒精（2∶1）的混合液，暗反應(yīng)2 h，取上清液，沉淀物中再加入5 mL，暗反應(yīng)2 h，之后合并上清液，定容至10 mL。然后，取樣品吸入光徑為1cm的比色杯內(nèi)，提取液為空白對(duì)照，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為663、645 nm，測(cè)定吸光度。最后按照以下公式計(jì)算，求得不同提取液中葉綠素a（Ca）、葉綠素b（Cb）和總?cè)~綠素（CT）的質(zhì)量濃度。再按照“葉綠體色素的含量＝色素濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)÷樣品鮮質(zhì)量”來(lái)計(jì)算組織單位質(zhì)量中各色素的含量。

Ca（mg/L）＝ 12.7×OD663－ 2.69×OD645；

Cb（mg/L）＝ 22.9×OD645－ 4.86×OD663；

CT（mg/L）＝ 12.7×OD663－ 2.69×OD645；

葉 綠 素 A 的 含 量（mg/g） ＝Ca×10×(1/1000)÷0.2 ＝Ca×0.05；

葉 綠 素 B 的 含 量（mg/g） ＝Cb×10×(1/1000)÷0.2 ＝Cb×0.05；

總?cè)~綠素含量（mg/g）＝Ca＋Cb。

2 結(jié)果與分析

2.1 PP333質(zhì)量濃度及保存時(shí)間對(duì)非洲菊叢生芽生長(zhǎng)的影響

分別將經(jīng)過3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月離體低溫保存的非洲菊叢生芽取出，統(tǒng)計(jì)相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果表明，生長(zhǎng)延緩劑PP333和保存時(shí)間對(duì)非洲菊叢生芽的生長(zhǎng)影響較大，分別表現(xiàn)在叢生芽的增殖、植株高度、葉片黃化和植株褐化方面，對(duì)葉片中的葉綠素含量也有明顯影響。

首先，PP333對(duì)低溫下的非洲菊叢生芽的分化和增殖具有明顯的抑制作用。隨著PP333質(zhì)量濃度增高，增殖系數(shù)明顯下降（見圖1）。同時(shí)，隨著離體低溫保存時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖系數(shù)不再升高，即第6個(gè)月和第9個(gè)月與第3個(gè)月相比，增殖系數(shù)不再增加，說明保存后期芽的增殖和分化已停止。

圖1 PP333質(zhì)量濃度及離體低溫保存時(shí)間對(duì)非洲菊芽增殖系數(shù)的影響Fig. 1 Effects of PP333 mass concentration and low temperature preservation time in vitro on multiplication coef fi cient of buds in G. jamesonii

其次，PP333縮短節(jié)間伸長(zhǎng)、矮化非洲菊芽叢的作用顯著（見圖2）。在低溫下不添加PP333的對(duì)照組中，芽的平均高度在3.36～4.02cm之間，而且隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組的芽在低溫下還在增高，但隨著PP333質(zhì)量濃度增高，芽體平均高度開始下降（見圖3）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這種抑制芽伸長(zhǎng)的作用變得不再顯著。經(jīng)5mg/L的PP333處理后，非洲菊的叢生芽高度比接種時(shí)芽體矮很多，經(jīng)3個(gè)月后新產(chǎn)生的芽高0.61cm，第6、9個(gè)月后，芽體高度平均值為0.6cm。分析其中還有一個(gè)原因，在統(tǒng)計(jì)高度時(shí)，是以活的芽體高度作為基數(shù)，但由于有褐化死亡的材料，因此統(tǒng)計(jì)高度上會(huì)有少量誤差。

圖2 PP333質(zhì)量濃度及離體低溫保存時(shí)間對(duì)非洲菊增殖芽高的影響Fig. 2 Effects of PP333 mass concentration and low temperature preservation time in vitro on height of multiplication buds in G. jamesonii

圖3 不同質(zhì)量濃度的PP333對(duì)非洲菊增殖芽低溫保存的影響Fig. 3 Effect of different mass concentrations of PP333 on low temperature preservation of multiplication buds in G. jamesonii

植物在低光照度的環(huán)境中，葉片會(huì)發(fā)黃，表現(xiàn)出光合速率低的癥狀。試驗(yàn)中低溫保存的光照強(qiáng)度為300 lx，光強(qiáng)弱，因此出現(xiàn)大量黃化苗，葉色淺綠或黃，葉薄，而且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，這種現(xiàn)象愈加顯著。對(duì)照組中，從第3、6、9個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)的黃化率分別為5.2%、16.7%、68.4%，說明低溫保存時(shí)間對(duì)對(duì)照組的黃化率的影響具有極顯著的差異。隨著PP333質(zhì)量濃度增加，非洲菊芽的黃化率總體呈現(xiàn)降低趨勢(shì)（見圖4）。葉色變得深綠，葉色變得肥厚。隨著離體培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，黃化率也逐漸增高。在9個(gè)月的統(tǒng)計(jì)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，添加有PP333的組合中雖然黃化率比對(duì)照組低，但是與同質(zhì)量濃度的6個(gè)月的黃化率相比，差異很大，黃化率都迅速增加。這可能與營(yíng)養(yǎng)成分已被消耗盡和PP333的有效作用時(shí)間相關(guān)。因此作為離體保存，為減少黃化苗的發(fā)生，應(yīng)該在6個(gè)月低溫保存后取出復(fù)壯1次。

圖4 PP333質(zhì)量濃度及離體低溫保存時(shí)間對(duì)非洲菊增殖芽黃化率的影響Fig. 4 Effects of PP333 mass concentration and low temperature preservation time in vitro on etiolation rate of multiplication buds in G. jamesonii

在非洲菊離體低溫保存中，除了葉片黃化現(xiàn)象外，葉片和植株褐化現(xiàn)象也存在。褐化的原因很多，本試驗(yàn)中褐化的產(chǎn)生是因?yàn)镻P333對(duì)植株生長(zhǎng)的脅迫作用而導(dǎo)致組織死亡。從圖5中可以看出，褐化率的變化隨PP333質(zhì)量濃度的增加而在升高，在同一處理質(zhì)量濃度下也隨著低溫保存時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在對(duì)照組中，一直沒有出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，而在PP333質(zhì)量濃度高達(dá)5mg/L時(shí)，9個(gè)月后的褐化率高達(dá)33.3%。

圖5 PP333質(zhì)量濃度和離體低溫保存時(shí)間對(duì)非洲菊增殖芽褐化率的影響Fig. 5 Effects of PP333 mass concentration and low temperature preservation time in vitro on browning rate of multiplication buds in G. jamesonii

2.2 PP333質(zhì)量濃度對(duì)非洲菊葉綠素含量的影響

葉綠素含量是植物生長(zhǎng)狀態(tài)的一個(gè)反映，當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，各種生理過程都會(huì)受到影響，如遇低溫植物的光合酶活性和光合電子傳遞速率下降，從而削弱植物利用光能的能力，引起光抑制現(xiàn)象[4]。此時(shí)植物葉綠素的含量和組成發(fā)生改變，植物的光合速率下降[5-6]。本試驗(yàn)中取離體低溫保存6個(gè)月經(jīng)不同PP333質(zhì)量濃度培養(yǎng)的叢生芽，測(cè)定幼葉的葉綠素a（Ca），葉綠素b（Cb）和總?cè)~綠素含量（CT），統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。從表1中可以看出，隨著PP333質(zhì)量濃度的升高，葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均成比例地升高，PP333質(zhì)量濃度為1.0mg/L時(shí)，總?cè)~綠素含量相對(duì)最高（0.571mg/g），光合速率最強(qiáng)。隨著質(zhì)量濃度的進(jìn)一步升高，葉綠素含量開始緩慢下降，說明PP333高于1.0mg/L對(duì)非洲菊離體保存苗來(lái)說開始受抑制，光合速率也開始下降。

表1 PP333質(zhì)量濃度對(duì)非洲菊葉片葉綠素含量的影響Table 1 Effects of PP333 mass concentrations on chlorophyll contents in G. jamesonii leaves

3 結(jié)論與討論

（1）非洲菊叢生芽在MS＋6-BA 0.5mg/L的培養(yǎng)基中添加1.0mg/L PP333，低溫12 ℃離體保存效果最佳，6個(gè)月后復(fù)壯1次。通過低溫和一定濃度的生長(zhǎng)抑制劑PP333的共同作用，不僅能獲得健壯的試管苗，而且能使保存時(shí)間延長(zhǎng)至6個(gè)月之久。

（2）離體低溫保存是在低溫下通過改變培養(yǎng)基成分和光照條件保存緩慢生長(zhǎng)離體培養(yǎng)物的方式。緩慢生長(zhǎng)離體保存成功的重要機(jī)制之一是增加了葉肉細(xì)胞的緊密度，提高了試管苗的抗氧化能力[7]。植物離體低溫保存可以收集和保存種質(zhì)資源，減少多次繼代帶來(lái)的種質(zhì)變異，同時(shí)節(jié)約空間，節(jié)約人力物力。種質(zhì)資源低溫保存泛指超低溫保存（－80 ℃以下）和低溫保存（4 ℃以下），而對(duì)植物而言，低溫常常是指那些比常溫稍低一些的溫度。離體低溫保存技術(shù)在許多園藝植物中得到了應(yīng)用[8-9]，如桉樹的花粉在低溫（－20 ℃）和超低溫（－80 ℃）冷凍真空條件下儲(chǔ)藏1 a，花粉活力依然能保持50%以上[10]。試驗(yàn)通過低溫結(jié)合生長(zhǎng)延緩劑和減少光照3個(gè)方面來(lái)共同抑制生長(zhǎng)和控制芽體高度，使芽體更加健壯。這種保存方法叫緩慢生長(zhǎng)保存（slow growth conservation），適合于植物中短期保存。影響離體低溫保存的因素還有很多，就緩慢生長(zhǎng)保存而言，還有增加蔗糖、甘露醇等高滲物質(zhì)抑制培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)，延緩細(xì)胞生長(zhǎng)，或采用適當(dāng)?shù)姆饪谀さ却胧11]，另外保存材料的生長(zhǎng)狀態(tài)及基因型等也會(huì)影響低溫保存的質(zhì)量。今后可以考慮在影響非洲菊離體低溫保存的因素上進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，同時(shí)通過細(xì)胞學(xué)和分子手段來(lái)檢測(cè)低溫保存材料的遺傳和變異。

（3）非洲菊為熱帶花卉，15 ℃以下生長(zhǎng)不良，在10 ℃以下則停止生長(zhǎng)，5 ℃以下低溫則受害嚴(yán)重，因此，試驗(yàn)中選擇12 ℃作為非洲菊低溫保存溫度。為避免非洲菊幼苗在短時(shí)間內(nèi)受低溫傷害，接種后對(duì)處理材料進(jìn)行了低溫?zé)捗?，?shí)施逐級(jí)降溫法，提高幼苗的抗凍能力。先后在18、15 ℃中煉苗一段時(shí)間后，最后才在12 ℃恒溫光控培養(yǎng)箱中保存培養(yǎng)。離體保存條件下，植株存活率高，生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，保存時(shí)間較長(zhǎng)，則適合該物種離體保存[7]。本試驗(yàn)中經(jīng)低溫保存后的材料受到不同程度的傷害，主要表現(xiàn)在老葉變褐色，葉片水漬狀受害。過度低溫會(huì)破壞葉綠素結(jié)構(gòu)[12]，葉綠素活性受到抑制，甚至葉綠素本身開始降解，葉綠素總含量降低，這是低溫逆境下光合機(jī)能的破壞導(dǎo)致植物死亡的原因之一。在9個(gè)月后受傷材料已過半，而將低溫保存6個(gè)月的材料在常溫弱光下培養(yǎng)1周后，再繼代入新鮮培養(yǎng)基中，在正常光照下培養(yǎng)，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，幼苗生長(zhǎng)正常。

[1]Parthasarathy VAV Nagaraju.In vitropropagation inGerbera jamesoniiBolus[J]. Indian Journal of Horticulture, 1999,56： 82 － 85.

[2]Broek Van Den L, Haydu JJ, Hodges AW,et al. Production,marketing and distribution of cut flowers in the United States and Brazil[C]//Annual Report of Florida Agricultural Experiment Station. University of Florida, 2004：1 － 19.

[3]王曉紅.荷蘭盆栽非洲菊欲征服美國(guó)市場(chǎng)[J].中國(guó)花卉園藝,2014, (2)：58 － 59.

[4]盧廣超,許建新,薛 立,等.低溫脅迫對(duì)4種幼苗的葉綠素?zé)晒馓卣鞯挠绊慬J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2014,34(2)：44－49.

[5]楊柳青,張 柳,廖飛勇,等.低溫脅迫對(duì)南美天胡荽光合作用和葉綠素?zé)晒獾挠绊慬J].經(jīng)濟(jì)林研究,2014,32(4)：99－102.

[6]孫曉方,何家慶,黃訓(xùn)端,等.不同光強(qiáng)對(duì)加拿大一枝黃花生長(zhǎng)和葉綠素?zé)晒獾挠绊慬J].西北植物學(xué)報(bào),2008,28(4)：752－758.

[7]潘學(xué)軍,李 霞,張文娥.離體保存對(duì)野生毛葡萄試管苗生長(zhǎng)及葉片抗氧化酶活性的影響[J].果樹學(xué)報(bào),2013,30(4)：615－620.

[8]Besseanhinder J J E, Staritsky G, Zandvoort E A. Loytennin vitrostorage ofColornsia esculentaunder minimal growth [J].Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1993, 33(2)：121 － 127.

[9]趙艷華,吳雅琴,程和禾,等.李離體莖尖的超低溫保存[J].園藝學(xué)報(bào),2008,35(3)：426－426.

[10]劉麗婷,武海霞,莫曉勇,等.不同處理和儲(chǔ)藏條件下桉樹花粉活力變化研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 31(8)： 56－60.

[11]王海平,李錫香,沈 鏑,等.離體保存技術(shù)在無(wú)性繁殖蔬菜種質(zhì)資源保存中的應(yīng)用[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2010, 11(1)：52－56.

[12]劉 芬,姜清彬,馬英姿.7個(gè)短枝木麻黃種源耐寒評(píng)價(jià)及綜合分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2015,35(6)：40－44.

Effects of PP333 on low-temperature preservation ofGerbera jamesoniiBolusin vitro

WANG Xiao-hong, TAN Xiao-feng, HU Fang-ming, YANG Wei
(Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

In order to extend the low temperature preservation period ofGerbera jamesoniiBolusin vitro, using clump budsin vitroas materials, the effects of growth retardant PP333 on mass concentration and preservation time on low temperature conservationin vitrowere researched. The results showed that PP333 had a signi fi cant in fl uence on bud growth combined with low temperature. Evidently, PP333 mass concentration was negatively correlated with shoot height, multiplication coefficient, and etiolation rate, but positively correlated with browning rate. With extending preservation timein vitro, etiolation rate was increased signi fi cantly, thus to rejuvenate after low-temperature preservation for six months was suitable. It was best to conserve clump buds in MS media with BA 0.5mg/L and PP333 1.0mg/L at 12 ℃.

Gerbera jamesoniiBolus; growth retardant PP333; tissue culture; low-temperature preservationin vitro

S682.1

A

1003—8981(2015)04—0086—04

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.04.015

2015-05-05

湖南省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（09JJ4013）；中南林業(yè)科技大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目（2009052B）。

王曉紅，副教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：wxhznl@126.com

王曉紅,譚曉風(fēng),胡芳名,等.非洲菊離體低溫保存研究[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2015,33(4)：86－89.

[本文編校：聞 麗]