(瓊州學(xué)院 理工學(xué)院，海南 三亞572022)

0 引言

黃酮類化合物是一類存在于自然界的、具有2－苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物.黃酮類化合物有廣泛的藥用價(jià)值，具有抗氧化、清除氧自由基、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)作用［1－3］.并且具有抗菌、抗癌的作用以及降血糖的活性［4－5］.

菠蘿是世界名果之一，具有良好的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效.菠蘿皮渣是菠蘿加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物，占總重量的50%～60%，其中菠蘿皮約占30%［6］.如果不加以處理，將會對環(huán)境造成嚴(yán)重污染，也會對資源造成極大浪費(fèi).相關(guān)研究表明菠蘿皮中富含黃酮等抗氧化活性物質(zhì)［7］，如果對其加以提取，在提高菠蘿廢棄物價(jià)值的同時(shí)，也增加了黃酮的來源途徑.

在黃酮類化合物的提取中，超聲提取技術(shù)、微波提取法和超臨界流體萃取技術(shù)等［8］是近年來文獻(xiàn)報(bào)道的一些廣泛應(yīng)用的現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù).超聲波提取技術(shù)提取速度、提取率比傳統(tǒng)提取方法更快更高，且不受成分極性因素、分子量大小因素的限制;還具有操作簡單、所提取料液雜質(zhì)含量少、有效成分容易分離和純化等特點(diǎn)［9］.Hromadkova［10］等人對比了傳統(tǒng)堿法和超聲輔助提取蕎麥中半纖維素的產(chǎn)率，證明經(jīng)短時(shí)超聲波處理后產(chǎn)率相比于傳統(tǒng)方法分別提高了1.2－1.5 倍.劉平懷等［11］利用循環(huán)超聲波技術(shù)提取廢棄菠蘿皮中的色素，其提取時(shí)間大為縮短，色價(jià)和提取率都有較大幅度提高.

本文采用超聲波輔助提取菠蘿皮中黃酮類化合物，確定了最佳提取工藝，并研究了菠蘿皮黃酮的抗氧化性.充分開發(fā)利用我省的菠蘿皮渣廢棄物資源，提高其利用率.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

菠蘿皮渣:收集市場新鮮菠蘿皮，處理后作為實(shí)驗(yàn)原料.

無水乙醇、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化亞鐵、硫氰酸銨，均為分析純.

1.1.2 主要儀器和設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司);UV－2550 紫外可見分光光度計(jì)(島津制作所);TDL－80－2B 離心機(jī)(金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司);JU－6224 調(diào)節(jié)型超聲發(fā)生器(上海杰恩超聲設(shè)備有限公司)等.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菠蘿皮黃酮類物質(zhì)的提取工藝流程

菠蘿皮渣→清洗→沸水熱燙滅酶10 min→60℃烘干→粉碎→過40 目篩→超聲輔助浸提→離心→上清→黃酮粗品.

1.2.2 菠蘿皮黃酮含量的測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取蘆丁0.0200 g 用60%乙醇配制成0.2000 mg/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用.

1.2.2.2 最大吸收波長的確定

準(zhǔn)確稱取1.0000 g 菠蘿皮渣干粉于錐形瓶中，加入60 %乙醇，搖勻并蓋上塞子，超聲輔助提取，功率為600W，時(shí)間為30 min.提取結(jié)束后抽濾，取濾液以3000 r/min 離心10 min.取3.0 mL 上清液，依次加入2.0 mL 5%的NaNO2溶液、2.0 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻放置6 min，最后加入10 mL 4% NaOH 溶液，定容至50 mL，靜置20 min 后測量，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液也經(jīng)相同的處理，分別在200－700 nm 進(jìn)行光譜掃描.

1.2.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，同1.2.2.2 的方法在最大波長344 nm 處測吸光值，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=28.774x+0.0272，R2=0.9969.

1.2.2.4 黃酮含量的計(jì)算

取3 mL 待測液于50 mL 容量瓶中，同1.2.2.2 方法，在最大波長處測吸光值.將測得的吸光值代入回歸方程，通過下面公式計(jì)算樣品中黃酮類物質(zhì)的提取率.

式中:c—樣品中黃酮化合物的濃度，mg/mL;

v1—黃酮粗提液總體積，mL;

v2—顯色反應(yīng)定容體積，mL;

v3—測定取樣體積，mL;

w—樣品質(zhì)量，g.

1.2.3 超聲輔助提取黃酮類物質(zhì)的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 超聲波功率對菠蘿皮黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，料液比1∶50，分別于360、480、600、720、840W 功率下超聲25 min.

1.2.3.2 超聲時(shí)間對菠蘿皮黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，料液比1∶50，于600 W 功率下分別超聲15、20、25、30、35、40 min.

1.2.3.3 提取劑濃度對菠蘿皮黃酮提取率的影響

料液比為1∶50，分別選用20%、30%、40%、50%、60%、70%體積分?jǐn)?shù)的乙醇作提取劑，在600 W 功率下超聲25 min.

1.2.3.4 料液比對菠蘿皮黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，分別選用1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80 的料液比，在600 W 功率下超聲25 min.

1.2.4 超聲輔助提取黃酮類物質(zhì)正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，選擇影響黃酮得率的四個(gè)主要因素，即:超聲功率(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)和料液比(D)，每個(gè)因素各選取三個(gè)適宜的水平，按照L9(34)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，見表1.

表1 菠蘿皮黃酮超聲波提取工藝正交實(shí)驗(yàn)因素和水平表

1.2.5 菠蘿皮中黃酮類化合物的抗氧化性研究

參照俞堅(jiān)［12］的方法，分別取4.00 mL 黃酮含量為24.93 mg/g 的待測樣品溶液置20 mL 具塞試管中，依次加入4.10 mL 亞油酸，、8.00 mL 磷酸緩沖液(0.05 mol/L，pH7.0)和3.90 mL 蒸餾水，混勻，在40℃放置30 min 后，取0.10 mL 上述反應(yīng)液，依次加入9.70 mL 75%乙醇、0.10 mL 30%硫氰酸銨和0.10 mL 0.02 mol/L氯化亞鐵，混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)3 min 后，測定500 nm 處的吸光值.以后每隔1 天取0.10mL 上述反應(yīng)液，按同樣的方法測定500 nm 處的吸光值，直到空白對照組的吸光值達(dá)到最大.

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿皮黃酮類物質(zhì)紫外可見吸收光譜

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和菠蘿皮黃酮的吸收光譜圖

菠蘿皮黃酮類物質(zhì)和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在200－700 nm 處掃描紫外—可見吸收光譜于圖1.由圖1可知，菠蘿皮黃酮類物質(zhì)主要吸收峰集中在330－370 nm 之間，與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜相似，后續(xù)研究以最大吸收峰值的波長344 nm 為檢測波長.

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析

2.2.1 超聲波功率對菠蘿皮黃酮提取率的影響

由圖2可知，超聲功率在360－600 W 之間時(shí)，隨著超聲功率的增大，黃酮的提取率明顯增加;功率大于600 W 時(shí)，黃酮含量明顯下降，這可能是因?yàn)槌暪β蔬^高，提取溫度會發(fā)生較大波動(dòng)，過大的能量產(chǎn)生的瞬間高溫往往會使熱不穩(wěn)定類黃酮類化合物分解或部分分解.因此超聲功率選用600 W 為宜.

2.2.2 超聲時(shí)間對菠蘿皮黃酮提取率的影響

圖2 超聲波功率對菠蘿皮黃酮提取率的影響

圖3 超聲時(shí)間對菠蘿皮黃酮提取率的影響

由圖3可知，超聲時(shí)間在10－15 min 范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長，菠蘿皮黃酮類化合物提取率呈線性增長，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到25 min 時(shí)，黃酮得率最高，繼續(xù)延長提取時(shí)間，黃酮類物質(zhì)的提取率呈下降趨勢，這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過長，超聲波的熱效應(yīng)影響了黃酮類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu);同時(shí)，提取時(shí)間過長會使雜質(zhì)的溶出量增加，影響黃酮的提取率［13］.因此，提取時(shí)間選擇25 min 合適.

2.2.3 提取劑濃度對菠蘿皮黃酮提取率的影響

由圖4可知，在乙醇濃度為20－30%范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度升高，菠蘿皮黃酮提取率緩慢增加，在30－40%范圍內(nèi)，菠蘿皮黃酮提取率呈線性增長，再增大提取劑濃度，提取率反而下降.因?yàn)榈蜐舛纫掖迹崛〔怀浞?，而且水溶性雜質(zhì)易溶出，給后續(xù)的分離純化帶來困難.高濃度乙醇，提取過程中揮發(fā)嚴(yán)重，并且醇溶性雜質(zhì)也增多，影響菠蘿皮黃酮的提取效果.

2.2.4 料液比對菠蘿皮黃酮提取率的影響

圖4 乙醇濃度對菠蘿皮黃酮提取率的影響

圖5 料液比對菠蘿皮黃酮提取率的影響

在相同超聲波提取條件下，隨著料液比的增加，菠蘿皮黃酮類化合物提取得率也不斷的提高，當(dāng)料液比達(dá)到1:50 后，黃酮類化合物提取得率幾乎不再增加，料液比繼續(xù)增大后，黃酮提取率呈下降趨勢.初步推斷是因?yàn)榱弦罕冗_(dá)到一定值后，黃酮類物質(zhì)達(dá)到溶解平衡，同時(shí)雜質(zhì)溶出量有所增加.

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

按照表1安排試驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過表2的方差分析可知，在對菠蘿皮黃酮提取率影響較大的四個(gè)因素中，乙醇濃度的影響最大，其次是料液比，再次是超聲波功率，最后是超聲時(shí)間.最佳的提取工藝為A2B1C3D2，即超聲功率600 W，超聲時(shí)間20 min，料液比為1:60，乙醇濃度為40 %.在此條件下，菠蘿皮黃酮提取率可高達(dá)2.493%.

2.4 菠蘿皮黃酮類化合物抗亞油酸氧化能力

抗亞油酸氧化法是評價(jià)抗氧化能力的常用方法.脂質(zhì)氧化的生成物主要是過氧化物，在酸性條件下，過氧化物把二價(jià)鐵離子氧化成三價(jià)鐵離子，三價(jià)鐵離子和硫氰酸根形成紅色的硫氰酸鐵，該絡(luò)合物在500 nm處附近有強(qiáng)的特征吸收，通過比色即可測出過氧化物的含量.吸光值越高表明亞油酸氧化程度越高［14］.從圖6可以看出菠蘿皮黃酮類化合物抑制了亞油酸氧化，可能是因?yàn)榧尤氲狞S酮醇及其苷能夠很好的抑制亞油酸過氧化物的形成，降低了過氧化物的形成速率.

圖6 菠蘿皮黃酮類化合物抗亞油酸氧化能力

3 結(jié)論

超聲波輔助提取菠蘿皮中黃酮類物質(zhì)的最優(yōu)工藝條件為:超聲功率600 W，超聲時(shí)間20 min，料液比為1∶60，乙醇濃度為40%.在此條件下，菠蘿皮黃酮提取率可高達(dá)2.493%.黃酮類化合物具有抗氧化的生物活性，從菠蘿皮中提取的黃酮類化合物具有抗亞油酸氧化能力.

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