趙 蓓 王承明 張沙沙

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢 430070）

菜籽粕中清蛋白的超聲輔助提取及氨基酸組成研究

趙 蓓 王承明 張沙沙

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢 430070）

以脫脂菜籽粕為原料，在單因素試驗基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化菜籽清蛋白的超聲輔助提取工藝，研究液料比、提取時間、超聲溫度、超聲功率對菜籽清蛋白提取率的影響；并對得到的產(chǎn)品進行氨基酸組成分析。結(jié)果表明，最佳的工藝條件為液料比18 mL/g，提取時間62 min，超聲溫度42℃，超聲功率80 W，且最優(yōu)條件下實際提取率為8.53%；氨基酸分析結(jié)果顯示，菜籽清蛋白中氨基酸種類齊全，必需氨基酸組成均衡，符合FAO/WHO推薦模式，是一類優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源。

菜籽清蛋白 超聲輔助 優(yōu)化 氨基酸組成

根據(jù)植物蛋白在不同溶劑中的溶解性差異，可分為水溶性（清蛋白）、鹽溶性（球蛋白）、堿溶性和醇溶性蛋白質(zhì)。菜籽中主要的蛋白質(zhì)包括2S清蛋白和12S球蛋白，分別占蛋白質(zhì)總含量的13.4%～46.1%和25%～65%[3]。此外，還有分子量較小的如硫堇、胰島素抑制劑和脂轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)（lipid transfer protein，LTP），這些蛋白組分不僅理化性質(zhì)良好，而且具有較強的生物活性[4]，其中2S清蛋白中含硫氨基酸、賴氨酸含量相對較高，功能性質(zhì)方面優(yōu)于12S球蛋白[5]。

目前，菜籽蛋白的研究多以自制冷榨菜籽粕為原料，提取方法主要有水相法和有機溶劑法[6－7]。薛照輝等[8]通過對等電點沉淀法和飽和硫酸銨法的研究對比，探討了如何提高冷榨菜籽粕中分離蛋白的提取率；熊志勇等[9]測定了中雙119甘藍型油菜脫殼脫脂風干菜籽粕中水溶性、鹽溶性、堿溶性和醇溶性蛋白質(zhì)占總蛋白含量分別為40.0%、34.9%、23.1%和1.9%。Chabanon等[10]對菜籽蛋白（清蛋白和球蛋白）進行酶法水解，改善其水解物功能性質(zhì)。超聲波技術(shù)作為一種近年發(fā)展起來的物理提取方法，具有操作簡便、提取時間短、提出率高等特點，目前己開始應(yīng)用在生物活性物質(zhì)的提取方面[11]。本研究主要以傳統(tǒng)熱榨菜籽粕為原料，采用超聲輔助提取菜籽清蛋白并進行工藝優(yōu)化，對提取得到的菜籽清蛋白樣品進行氨基酸組成分析，旨在為其開發(fā)利用提供有力的參考依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菜籽餅粕：益海嘉里（武漢）糧油工業(yè)有限公司，粉碎后過60目篩，石油醚脫脂。

1.2 主要儀器

AL204分析天平：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：武漢科爾儀器設(shè)備有限公司；KQ 2200DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；K9840自動凱氏定氮儀：濟南海能儀器有限公司；TDL－5－A臺式大容量離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；RE－2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲波輔助提取與攪拌浸提菜籽清蛋白對比試驗

取10 g菜粕置于燒杯中，加入150 mL去離子水，40℃下超聲輔助提取60 min，同條件下攪拌浸提作對比。5 000 r/min離心15 min后測定上清液中蛋白質(zhì)含量，離心后沉淀重復(fù)提取4次并測定蛋白總提取率。

1.3.2 提取工藝的優(yōu)化設(shè)計

1.3.2.1 單因素試驗

以清蛋白的提取率為判斷依據(jù)，選取不同的液料比、提取時間、超聲溫度、超聲功率為影響因素，進行菜籽粕中清蛋白提取的單因素試驗。

為了突破由“六級修”維修工作量時間集中性明顯而導(dǎo)致的維修作業(yè)年度時間段內(nèi)工作量分布不均、車輛上線率不高的維修集約瓶頸，“均衡修”維修集約范式將“工作量均衡化”作為維修程式變化的核心理念，制定出分散到12個月度的、工作量相對平均的12項維修活動，如表3所示。同時，該維修集約范式充分利用車輛運營高峰回庫的窗口時間，完成維修作業(yè)內(nèi)容。

1.3.2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box－Behnken試驗設(shè)計原理，選取液料比、提取時間、超聲溫度及超聲功率為影響因素，清蛋白提取率為響應(yīng)值，采用四因素三水平響應(yīng)面法進行試驗，因素水平編碼見表1。

1.3.3 氨基酸組成分析

樣品制備：將蛋白質(zhì)提取液進行濃縮，采用75%飽和硫酸銨分離蛋白質(zhì)，醇洗沉淀后進行透析，最后真空冷凍干燥得到清蛋白粉末。

氨基酸的測定參照GB/T 5009.124—2003。取適量清蛋白粉末進行酸水解成游離氨基酸后，經(jīng)氨基酸分析儀分析其氨基酸組成。

色氨酸的測定參照GB 7650—1987。

1.3.4 蛋白質(zhì)的測定

蛋白質(zhì)含量根據(jù)GB/T 5009.5—2010采用半微量凱氏定氮法。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取與攪拌提取的對比結(jié)果

為提高菜籽清蛋白的提取率，分別進行超聲輔助和攪拌提取，結(jié)果見圖1。超聲輔助提取時的菜籽清蛋白提取率要高于攪拌提取時的提取率，并且總趨勢均隨提取次數(shù)的增加而增加，提取4次后清蛋白提取率接近平衡，從節(jié)約溶劑和能源的角度考慮，后續(xù)試驗優(yōu)化可選擇提取1次。

圖1 提取次數(shù)對提取率的影響

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 液料比對清蛋白提取的影響

取10 g菜籽粕依不同比例加入相應(yīng)體積的去離子水，40℃、70 W超聲輔助浸提1 h，離心后測上清液中蛋白質(zhì)含量，考察液料比對清蛋白提取率的影響。由圖2可看出，隨著液料比的增大，菜籽清蛋白的提取率先呈上升趨勢，當液料比為15 mL/g時達到最高，大于15 mL/g提取率有所下降。當液料比小時，提取液濃度過高，體系黏度大，造成蛋白分離困難；隨著溶劑的增加，有效成分浸出越完全，提取率就越大；但當溶劑量過大時，超聲對菜籽粕顆粒產(chǎn)生的空化和機械效應(yīng)強度減弱，從而影響超聲對清蛋白的提取效果，同時會造成溶劑的浪費。因此，液料比可確定為15 mL/g。

圖2 液料比對提取率的影響

2.2.2 提取時間對清蛋白提取的影響

取10 g菜籽粕，選取液料比15 mL/g，40℃、70 W超聲輔助浸提不同時間，離心后測上清液的蛋白質(zhì)含量，考察提取時間對清蛋白提取率的影響。由圖3可看出，隨著提取時間的增加，菜籽清蛋白的提取率不斷增加，在60 min后增加變得緩慢，并趨于平穩(wěn)。因為短時間內(nèi)受到超聲空化作用，蛋白質(zhì)會充分與提取溶劑接觸，溶出率增加并隨著時間延長慢慢達到動態(tài)平衡，時間過長會造成能源浪費。因此，提取時間可確定為60 min。

圖3 提取時間對提取率的影響

2.2.3 超聲溫度對清蛋白提取的影響

取10 g菜籽粕，選取液料比15 mL/g，不同溫度下70 W超聲輔助浸提1 h，離心后測上清液的蛋白質(zhì)含量，考察溫度對清蛋白提取率的影響。由圖4可看出，隨著超聲溫度的升高，菜籽清蛋白的提取率不斷增大，在40℃后逐漸趨于平衡。溫度升高后，菜籽粕中的其他成分如水溶性色素也會溶出，使蛋白提取液色澤加深，而且溫度過高易使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，給后續(xù)操作帶來一定的困難，同時會造成能源損失。綜合考慮，超聲溫度可確定為40℃。

圖4 溫度對提取率的影響

2.2.4 超聲功率對清蛋白提取的影響

圖5 超聲功率對提取率的影響

取10 g菜籽粕，選取液料比15 mL/g、40℃，不同功率下超聲輔助浸提1 h，離心后測上清液的蛋白質(zhì)含量，考察超聲功率對清蛋白提取率的影響。由圖5可看出，隨著超聲功率的增加，菜籽清蛋白的提取率呈緩慢上升趨勢，在80 W時達到最高值。菜籽粕在受到加熱的同時，隨著超聲空化作用的增強，清蛋白提取率隨之增加；但高功率導(dǎo)致的熱效應(yīng)會使蛋白發(fā)生部分變性，從而導(dǎo)致某些性質(zhì)的改變，為其應(yīng)用造成限制。因此，超聲功率可確定為80W。

2.3 Box－Behnken試驗優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取液料比、提取時間、超聲溫度及超聲功率4個因素進行Box－Behnken試驗設(shè)計，共進行29次試驗，各因素安排及結(jié)果見表2。

表2 Box－Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

利用Design－Expert8.0.5軟件對Box－Behnken試驗結(jié)果進行多元回歸擬和，可得到清蛋白提取率對液料比（A）、提取時間（B）、超聲溫度（C）及超聲功率（D）的二次多項回歸模型為：

清蛋白提取率 ＝8．27＋0．54A＋0．21B＋0．33C＋0．15D－0．095AB＋0．072AC＋0．057AD－0．042BC－0．01BD＋0．018CD－0．41A2－0．42B2－0．54C2－0．57D2

對該模型進行方差分析和顯著性檢驗，模型方差分析結(jié)果見表3，回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果見表4。

表3 回歸模型方差分析

表4 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗

由表3方差分析結(jié)果可知，該模型P＜0.000 1，可看出回歸模型效果極顯著；失擬項P＝0.135 6＞0.05不顯著；相關(guān)系數(shù)R2為0.916 8，說明該模型擬合較好，試驗誤差小，可以用此模型來分析預(yù)測清蛋白的提取率。

由表4回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果可以看出，該模型的一次項A（液料比）、C（超聲溫度）影響極顯著，二次項均極顯著；一次項B（提取時間）影響顯著；一次項D（超聲功率）、交互項影響不顯著，各因素的影響大小依次為：A＞C＞B＞D。

對菜籽清蛋白的提取條件進行優(yōu)化，剔除回歸模型中不顯著項后，最佳提取工藝參數(shù)為：液料比18.4mL/g，提取時間61.5min，超聲溫度41.7℃，超聲功率81.7W，此時的理論提取值為8.55%。為驗證Box－Behnken試驗設(shè)計結(jié)果的可靠性，選取條件為液料比18 mL/g，提取時間62 min，超聲溫度42℃，超聲功率80 W，平行提取3次，平均提取率為8.53%，與理論預(yù)測值接近，其相對誤差為0.23%。

2.4 氨基酸組成分析

在營養(yǎng)學(xué)上常用氨基酸模式（AAP）反映某蛋白在必需氨基酸的種類和含量上的區(qū)別，方法是將色氨酸的含量定為1，分別計算出其他必需氨基酸的相應(yīng)比值[12]。對菜籽清蛋白進行氨基酸組成測定，其氨基酸種類及含量分析結(jié)果見表5。

表5 菜籽清蛋白的氨基酸組成與含量

從表5可知，菜籽清蛋白氨基酸種類齊全，含有18種氨基酸，總含量達73.19%，其中嬰兒所需必需氨基酸組氨酸占2.61%，必需氨基酸含量占氨基酸總量（E/T）的38.10%，必需氨基酸與非必需氨基酸含量比值（N/E）為0.62，均超過了 FAO/WHO標準推薦的36%和0.6，必需氨基酸模式接近WHO推薦人體蛋白需要模式，植物性蛋白往往缺少的精氨酸和蛋氨酸含量也很高，與谷物類蛋白一起可起到蛋白質(zhì)的互補作用[13]，含量最高的Asp和Glu是構(gòu)成人體血漿蛋白的重要成分。菜籽清蛋白中必需氨基酸組成均衡，有較好的營養(yǎng)價值，是一種有待開發(fā)食用的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)。

3 結(jié)論

3.1 通過攪拌提取與超聲波輔助浸提菜籽粕清蛋白的對比，選取較高提取率的超聲輔助方法，根據(jù)響應(yīng)曲面法中的Box－Behnken試驗設(shè)計，對清蛋白提取的工藝條件進行優(yōu)化，建立了以液料比、提取時間、超聲溫度、超聲功率為因素的二次多項回歸模型，方差分析表明方程擬合較好。對模型進行優(yōu)化后，最優(yōu)條件下實際提取率為8.53%，與理論預(yù)測值8.55%基本一致。

3.2 所制得菜籽清蛋白含18種氨基酸，且人體必需氨基酸種類齊全、組成平衡，是完全蛋白質(zhì)，氨基酸總量為73.19 g/100 g，必需氨基酸占氨基酸總量的38.10%，并且必需氨基酸組成模式符合FAO/WHO推薦標準，富含功能性氨基酸，能彌補一些谷物類蛋白的部分氨基酸不足，是一種具有開發(fā)食用前景的植物蛋白資源。

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Ultrasound－Assisted Extraction and Amino Acid Composition of Napin from Rapeseed Meal

Zhao Bei Wang Chengming Zhang Shasha

（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070）

The optimization of ultrasound－assisted extraction for napin（rapeseed albumin）from defatted rapeseed meal has been determined with single factor experiments and response surface analysis.Effects of liquid/meal ratio，extraction time，ultrasonic temperature and ultrasonic power on napin extraction yield have been studied in the paper，and the amino acid composition（AAC）of obtained napin has also been analyzed.The optimal extraction conditions were liquid/meal ratio of 18 mL/g，extraction time of62 min，ultrasonic temperature of42℃ and ultrasonic power of 80 W.On the optimal conditions，the actual extraction rate of napin was8.53%.The results of AAC indicated that the napin was richly contained in all kinds of amino acids.The AAC of napin was balanceable and it complied with the FAO/WHO recommendation pattern.It could be judged that napin could be considered as a fine resource of vegetable protein.

napin（rapeseed albumin），ultrasound－assisted，optimization，amino acid composition

TQ432.2

A

1003－0174（2015）10－0032－05

2014－04－17

趙蓓，女，1989年出生，碩士，食品營養(yǎng)與安全

王承明，男，1964年出生，教授，食品品質(zhì)控制及安全