祁 景 劉小軍 周明鍇

鄭州大學第二附屬醫(yī)院ICU 鄭州 450014

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種嚴重威脅人類健康的重大疾病［1］。本實驗從細胞替代、旁分泌腦源性生長因子和促進突觸再生的角度，探討神經(jīng)干細胞（neural sfem celle，NSCS）移植改善腦出血大鼠神經(jīng)功能的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組及模型制作 動物的飼養(yǎng)和后續(xù)所有相關實驗程序均經(jīng)鄭州大學倫理委員會批準。SD大鼠由河南省動物中心提供。隨機選取雄性SD大鼠30只，分為3組：sham組（采用立體定位儀定位穿刺但不打入膠原酶）10只，ICH模型組（模型組，采用立體定位儀定位穿刺并打入膠原酶并鑒定合格）10只，NSCS細胞干預組（NSCS組，采用立體定位儀定位穿刺并鑒定合格后注射NSCS 1×106）10只，參照文獻［2］及George Paxinos大鼠腦立體定位圖譜，將大鼠取俯臥位，采用固定器，固定在大鼠腦立體定位儀上，以左側紋狀體為穿刺點（前囟后0.2mm，左側旁3mm，垂直6 mm）。采用10μL微量進樣器，在該穿刺點緩慢注入0.5μLⅦ型膠原酶溶液（sigma公司），留針約10min后緩慢退出穿刺針。術后清潔創(chuàng)面，縫合頭皮。術后24h內進行mNSS評分［3］，選取8～12分為符合標準納入分組內。

1.2 NSCS的培養(yǎng) 復蘇NSCS（本實驗室保存），給復蘇的NSCS每天更換細胞培養(yǎng)基（DMEM／F12，20%KSR，1mM L-谷氨酰胺，0.1mMβ巰基乙醇，0.1mM NEAA，10ng／mL bFGF），長至可以傳代。

1.3 神經(jīng)功能評分 采用mNSS評分（包括運動、感覺、平衡、反射）評價大鼠神經(jīng)功能缺損和恢復情況，各組均在術后1、3、7、14、28d評分。

1.4 腦組織取材 造模后28d提取各組大鼠腦組織標本，3～5只多聚甲醛灌注固定法固定腦組織，梯度蔗糖脫水后冰凍冠狀切片（厚12μm）。

1.5 免疫組織化學染色 各組切片做brdu（抗體均購自santa，一抗為鼠抗人，二抗為兔抗鼠）的免疫熒光染色，和BDNF和GAP-43（抗體均購自santa，一抗為兔抗鼠，二抗為山羊抗兔）的免疫組織化學染色。免疫組化采用imageJ進行陽性信號灰度值的測定分析。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，其中mNSS數(shù)據(jù)行重復測量分析，其余資料行單因素方差分析并行組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 各組各時間點mNSS評分結果，第14天起，各時間點NSCS組的評分明顯優(yōu)于模型組、假手術組（P＜0.05）

2 結果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 立體定向注射膠原酶誘導大鼠腦出血后，大鼠迅速出現(xiàn)出血、對側偏癱等神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)，癥狀體征于術后1～3d達高峰，隨后逐漸恢復。NSCS組較模型組后14d及28d的mNSS評分且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 Brdu免疫熒光染色 熒光顯微鏡下可見Brdu免疫熒光染色陽性的細胞明顯聚集分布于血腫周圍，血腫對側僅可見少量陽性細胞散在分布。見圖2。

圖2 綠色免疫染色為陽性，A為血腫周圍，B為血腫對側腦區(qū)（200×）

2.3 BDNF表達上升 BDNF在3組中均有表達，且在血腫周圍的表達量較高。免疫組化陽性細胞胞漿被染為棕褐色或棕黃色顆粒狀，陰性者除細胞核染成藍色外，無棕黃色反應物。BDNF在假手術組，模型組僅可見少量陽性細胞，NSCS組較兩者增多。結果顯示，NSCS組高于組模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5。

2.4 GAP-43表達上升 GAP-43在各組中也均有表達，GAP-43在NSCS組較假手術組與模型組表達增多見圖4。結果顯示NSCS組與假手術組的陽性細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

腦出血引起的神經(jīng)功能障礙，嚴重威脅人類健康和影響生活質量。隨著干細胞技術的發(fā)展，干細胞其衍生物成為人類神經(jīng)系統(tǒng)難治性疾病——腦出血富有應用前景的治療選擇之一［4］。

本實驗NSCS干預組第14天及第28天其神經(jīng)功能評分顯著優(yōu)于模型組。從行為學上表明NSCS移植在腦出血模型中具有確實的治療作用。

BDNF是一類多功能的多肽生長因子，具有調節(jié)神經(jīng)元的存活、分化，以及軸突導向和突觸的功能［5］。BDNF激活高親和力受體TrkB后有助于神經(jīng)存活，還具有調節(jié)突觸的結構和數(shù)量、促進新形成突觸的發(fā)育和成熟、促進樹突棘和軸突的生長等作用。我們通過免疫組織化學染色的方法檢測到BDNF分泌增多，證實了NSCS分化的細胞具有促進旁分泌的功能。本實驗通過立體定位向ICH大鼠移植NSCS，NSCS可促進BDNF的表達增多。

GAP-43是一種廣泛分布在神經(jīng)系統(tǒng)中的胞膜磷酸蛋白質［6］。GAP-43是可以促進神經(jīng)元發(fā)育和再生的一個重要的內在決定因子，它是由神經(jīng)元包體合成，與神經(jīng)軸突的生長密切相關，在神經(jīng)元發(fā)育和再生過程中，作為神經(jīng)元的損傷、修復及再生的重要分子標志物，隨著神經(jīng)軸突的生長大量合成［7］。BDNF能夠促進軸突生長錐表面GAP-43和軸突骨架蛋白β-tublin表達的上調從而促進軸突的延伸［8］。

本實驗進一步證實，NSCS的移植能夠改善局部的微環(huán)境、上調BDNF并啟動再生相關GAP-43的表達增多，進而促進腦出血后神經(jīng)功能的恢復?？傊?，我們以腦出血模型大鼠為研究對象，采用ICH患者來源的NSCS進行移植治療。結果表明NSCS移植能有效改善ICH模型大鼠的神經(jīng)功能障礙，其機制為細胞替代、旁分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和促進軸突再生等多個方面。

圖3 BDNF免疫組化染色，A假手術組，B模型組，NSCS組（400×）

圖4 GAP-43免疫組化染色，A假手術組，B模型組，NSCS組（400×）

圖5 BDNF及GAP-43免疫組化的灰度值，各組均為陽性，但NSCS組較假手術組、模型組灰度值均增多（P＜0.05）

［1］Lindvall O，Kokaia Z.Stem cells for the treatment of neurological disorders［J］.Nature，2006，441（5）：1 094-1 096.

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