高溫狀態(tài)影響實(shí)驗(yàn)小鼠精液質(zhì)量的研究與分析

陳杰翔李利①

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科四川瀘州646000；①護(hù)理部)

[摘要]①目的探討在不同高溫狀態(tài)下小鼠精液質(zhì)量的變化，為研究高溫狀態(tài)影響人類生育能力的機(jī)制提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。②方法將125只健康雄性成年昆明小鼠隨機(jī)分為5組，每組25只。對(duì)照組給予22℃恒溫飼養(yǎng)，高溫組下設(shè)31℃、34℃、37℃、40℃4個(gè)組，分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1、3、5、7、9天，每組隨機(jī)抽取5只小鼠，測(cè)定精子DNA及精子頂體完整率的變化情況。③結(jié)果與對(duì)照組相比，各高溫組實(shí)驗(yàn)小鼠的精液質(zhì)量均明顯異常，且溫度越高，精液質(zhì)量下降越快，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；隨著高溫持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，各高溫組實(shí)驗(yàn)小鼠的精液質(zhì)量呈現(xiàn)不同程度的異常，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。④結(jié)論高溫可能通過(guò)影響雄性小鼠精子DNA損傷及附屬性腺的功能，導(dǎo)致精子DNA及精子頂體完整率出現(xiàn)不同程度的異常，從而影響其生育能力。

[關(guān)鍵詞]高溫精液分析精子DNA精子頂體完整率

[中圖分類號(hào)]Q 33

【作者簡(jiǎn)介】陳杰翔(1976-)，副教授，主要研究方向：泌尿生殖外科。

Research and analysis of high temperature state affect on semen quality laboratory miceCHENJiexiang,LILi(DepartmentofUrology,AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,SichuanLuzhou646000,China)

ABSTRACT[]ObjectiveIn this study,adult male mice of different experimental animal models constructed under high temperature,measured changes in sperm DNA integrity and sperm acrosome integrity rate，and to explore the state under different temperature changes in semen quality in mice for the study of effects of high temperature mechanism to provide human fertility based on animal experiments.MethodsThe 125 healthy adult male mice were randomly divided into 5 groups，each group 25 mice，in which the control group to be 22℃ thermostat feeding，the group consists of high temperature 31℃、34℃、37℃、40℃ four groups，respectively，in the first days of the experiment began 1、3、5、7、9 randomly selected five mice per group measured changes in sperm DNA integrityand and acrosome integrity rate.Resultscompared with the control group,the semen quality of the high-temperature experiments in mice were significantly abnormal，and the higher the temperature，the faster the decline in semen quality，the difference was statistically significant (P<0.01)；With the high temperature duration the extended semen quality of the high-temperature experiments in mice showed varying degrees of abnormality，the difference was statistically significant (P<0.01).ConclusionHigh temperature may influence male sperm DNA damage and its subsidiaries gonadal function，leading to sperm DNA integrity and sperm acrosome integrity rate varying degrees of abnormality，thus affecting their fertility.

[KEYWORDS]High temperature.Semen analysis.Sperm DNA integrity.Acrosome integrity rate

由于環(huán)境污染、生活飲食方式的改變以及環(huán)境溫度變化等，人類精液質(zhì)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[1]。早期研究表明，高溫環(huán)境能誘導(dǎo)正常細(xì)胞的凋亡，但是否影響男性生殖功能及其確切機(jī)制目前還不十分明確。本研究以成年雄性昆明小鼠構(gòu)建不同高溫狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，測(cè)定精子DNA及精子頂體完整率的變化情況，探討在不同高溫狀態(tài)下小鼠精液質(zhì)量的變化,研究高溫狀態(tài)與小鼠精液質(zhì)量的相關(guān)性，從而為進(jìn)一步探討高溫影響人類生育能力的機(jī)制提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年健康雄性昆明小鼠125只，體質(zhì)量25～30g，6～8周齡(由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)小鼠均自由采食、飲水、活動(dòng)，日照時(shí)間12h。將125只小鼠隨機(jī)分為5組，每組25只。利用智能光照培養(yǎng)箱模擬不同的高溫環(huán)境，其中對(duì)照組給予22℃恒溫飼養(yǎng)，高溫組下設(shè)31℃、34℃、37℃、40℃4組，分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1、3、5、7、9d隨機(jī)抽取5只小鼠,測(cè)定每組精子DNA損傷情況及精子頂體完整率的變化情況。

1.2精子頂體完整率檢測(cè)采用頸椎脫臼法將實(shí)驗(yàn)小鼠處死，取兩側(cè)附睪尾部組織0.02 g，置2.0mL Ca2+濃度為1.3mmol/L的TYH培養(yǎng)液中剪碎，37℃、CO2孵箱溫育10min，使精子游離，加TYH液至4mL，調(diào)整精子濃度至(3～6)×106/mL，待檢。取處理過(guò)的精液1mL，置37℃、CO2孵箱溫育5h，使其獲能；1000r/min，離心3min，棄上清，沉淀以5%甲醛溶液固定10min，混勻，吸取50μL精子懸液滴于載玻片上涂片晾干，用0.22%考馬斯亮蘭G250染液浸染至少30min，蒸餾水沖洗，晾干。400倍顯微鏡下完整視野計(jì)數(shù)200條精子進(jìn)行精子頂體完整率分類。精子頂體完整率根據(jù)頂體的外形和損傷情況，將精子頂體分為4種類型，并計(jì)算頂體完整率。I型：頂體完整，精子外形正常，著色均勻，頂體邊緣整齊，有時(shí)可見(jiàn)清晰的赤道板；II型：頂體輕微膨脹，精子質(zhì)膜(頂體膜)疏松膨大；Ⅲ型：頂體破壞，精子質(zhì)膜嚴(yán)重膨脹受損，著色淺，邊緣不整齊；Ⅳ型：頂體全部脫落，精子核裸露。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型均為頂體不完整。頂體完整率(%)的計(jì)算：頂體完整率=(頂體完整精子數(shù)/精子總數(shù))×100%。頂體完整率大于75%為正常值。同一份精液樣本由2位專業(yè)檢測(cè)人員依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2010精液分析標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。

1.3染色體結(jié)構(gòu)分析(sperm chromosome structure analysis，SCSA)測(cè)定精子DNA完整性采用頸椎脫臼法將實(shí)驗(yàn)小鼠處死，取各組實(shí)驗(yàn)小鼠右側(cè)附睪組織制備精子懸液，40μL精子懸液中加入160μL TNE buffer(0.01mol/L Tris-cl，0.15mol/L NaCl，1mmol/L disodium EDTA，pH7.4) ，稀釋精子懸液至體積為200μL，密度1～2×106/mL，立刻加入400μL酸處理液(0.08mol/L HCl，0.15mol/L NaCl，0.1% W/V Triton，pH1.2)振蕩混勻，30s后加入1.2mL AO染液(6g/mL AO溶于0.037mol/L Citric-acid，0.12mol/L Na2HPO4，1.1mmol/L Disodium EDTA，0.15mol/L NaCl，pH6.0)30min。標(biāo)本用熒光顯微鏡(520nm激發(fā)光)觀察精子，用流式細(xì)胞液測(cè)定精子DNA片段化指數(shù)(DFI)。計(jì)數(shù)每只動(dòng)物200個(gè)精子中綠色、紅色和橙黃色精子數(shù)。其中綠色為DNA雙鏈精子、紅色為DNA單鏈、橙黃色為DNA雙鏈不穩(wěn)定精子。計(jì)算出紅色、橙黃色熒光精子的百分率，即為精子DNA碎片化指數(shù)(DNA fragmentation index，DFI)，精子DNA完整性=1-DFI。

2結(jié)果

不同高溫組實(shí)驗(yàn)小鼠精子DNA損傷及精子頂體完整率的變化情況,見(jiàn)表1，表2。

表1　對(duì)照組與各高溫組實(shí)驗(yàn)小鼠DFI檢測(cè)結(jié)果比較(%, ±s)

注：同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，與對(duì)照組比較,*P<0.01；與31℃比較,#P<0.01；與34℃比較,■P<0.01；與37℃比較,▲P<0.01；同一實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，與第1d比較,￥P<0.01；與第3d比較,￥P<0.01；與第5d比較,￥P<0.01；與第7d比較,￥P<0.01表2　對(duì)照組與各高溫組實(shí)驗(yàn)小鼠精子頂體完整率檢測(cè)結(jié)果比較(%, ±s)

注：同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，與對(duì)照組比較,*P<0.01；與31℃比較,#P<0.01；與34℃比較,■P<0.01；與37℃比較,▲P<0.01；同一實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，與第1d比較,￥P<0.01；與第3d比較,￥P<0.01；與第5d比較,￥P<0.01；與第7d比較,￥P<0.01

綜上可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，各高溫組實(shí)驗(yàn)小鼠的精液質(zhì)量均明顯異常，且溫度越高，精液質(zhì)量下降越快，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；隨著高溫持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，各高溫組實(shí)驗(yàn)小鼠的精液質(zhì)量呈現(xiàn)不同程度的異常，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3討論

過(guò)去的數(shù)十年中，全球的平均溫度升高了大約0.5℃，并且據(jù)預(yù)測(cè)將以更快的速度持續(xù)升高[2]。環(huán)境溫度的變化將對(duì)哺乳動(dòng)物的精液質(zhì)量產(chǎn)生一定程度的影響[3]。哺乳動(dòng)物的精子成熟過(guò)程較為復(fù)雜，其中包括睪丸內(nèi)精子的產(chǎn)生以及附睪內(nèi)精子的成熟，其適宜的溫度通常要比體溫低5℃~7℃。由于陰囊具有一定的溫度調(diào)節(jié)作用，從而使得睪丸內(nèi)始終保持精子產(chǎn)生的適宜溫度環(huán)境，但是這種調(diào)節(jié)能力具有一定的范圍，當(dāng)外界的溫度環(huán)境過(guò)高，超過(guò)了陰囊的調(diào)溫能力時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致陰囊內(nèi)睪丸溫度過(guò)高，影響精子的發(fā)生[4]；另外由于附睪同時(shí)位于陰囊內(nèi)，當(dāng)環(huán)境溫度超過(guò)陰囊的調(diào)節(jié)能力時(shí)，附睪內(nèi)精子的成熟也會(huì)受到影響，從而影響精子的受精能力和運(yùn)動(dòng)能力[5]。

精子頂體是精子細(xì)胞特有的結(jié)構(gòu)，其正常功能對(duì)精子受精能力起決定性的作用。精子頂體位于精子頭前端，覆蓋在精子核前面，由頂體帽與赤道板組成，是一個(gè)膜結(jié)合的帽狀結(jié)構(gòu)。頂體內(nèi)含有多種蛋白水解酶和磷酸酯酶，在頂體反應(yīng)時(shí)，這些酶釋放或暴露出來(lái)。幫助精子穿過(guò)卵細(xì)胞表面透明帶和放射冠，與其結(jié)合形成受精卵，從而完成受精。頂體完整率是反映頂體缺陷與否的重要指標(biāo)。檢測(cè)頂體完整率有助于提示精子的受精能力，因此可通過(guò)檢測(cè)精子頂體完整率來(lái)判斷精子獲能及潛在生育能力的狀況。完整頂體的活力精子呈酸性，可被嗜酸性探針L-Tracker特異性標(biāo)記，呈綠色熒光。頂體不完整常有以下情況：頂體缺乏、頂體薄、體積小、泡狀頂體、無(wú)內(nèi)容物或電子密度降低等。這些類型的精子頂體酶缺失或活性降低，使精子不能穿越卵細(xì)胞的放射冠和透明帶，導(dǎo)致受精率降低[6]。目前已經(jīng)發(fā)明的精子數(shù)字成像系統(tǒng)可以客觀地對(duì)精子核形態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)，自動(dòng)化的精子頭部形態(tài)測(cè)量系統(tǒng)不僅可以對(duì)精子頭部長(zhǎng)度、寬度、面積等參數(shù)進(jìn)行測(cè)量，還可以對(duì)這些數(shù)據(jù)的改變，如精子頭部的寬度與長(zhǎng)度以及精子的周長(zhǎng)等指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算，從而把精子分為生育組精子和不能生育組精子。精子頂體的缺陷與男性不育有密切關(guān)系，若將頂體形態(tài)分析作為精子形態(tài)學(xué)分析的診斷指標(biāo)之一，將對(duì)男性不育癥的實(shí)驗(yàn)診斷及臨床療效評(píng)估提供良好的應(yīng)用價(jià)值，可作為精子形態(tài)學(xué)及功能檢查的常規(guī)項(xiàng)目推廣應(yīng)用，為男性不育癥治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[7]。

精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法(SCSA)由Evenson等提出[8]：用熱或酸處理已液化的精子，由于受損傷和未成熟精子的魚(yú)精蛋白巰基未發(fā)生氧化，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，DNA在酸的作用下易變性成單鏈。吖啶橙是一種熒光絡(luò)黃染料，具有高度的異染性，以插入的方式與雙螺旋的DNA 分子結(jié)合，應(yīng)用吖啶橙染液的異染性可對(duì)損傷和正常的精子DNA進(jìn)行區(qū)分，以評(píng)估精子DNA的完整性。染色后斷裂的精子單鏈DNA在熒光顯微鏡下呈紅色熒光，而正常精子雙鏈DNA呈綠色熒光，其結(jié)果通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。此外，SCSA分析所獲另一項(xiàng)指標(biāo)-高DNA可染性(HDS)代表了呈強(qiáng)綠色熒光的精子百分率，可作為反映精子成熟度的指標(biāo)。SCSA參數(shù)反映了不同精子染色質(zhì)構(gòu)象的異質(zhì)性，操作快速簡(jiǎn)便，結(jié)果直觀可靠，可定量檢測(cè)，便于標(biāo)準(zhǔn)化，是臨床最常用的DNA完整性檢測(cè)方法[9]。細(xì)胞核DNA是精子的主要遺傳物質(zhì)，其完整性是遺傳物質(zhì)正確傳遞給子代的前提，對(duì)于子代的繁衍具有重要意義，在受精和胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。在人類精子發(fā)生過(guò)程中，染色質(zhì)的DNA結(jié)合蛋白主要為魚(yú)精蛋白，其在分子內(nèi)外能夠形成二硫鍵交聯(lián)，具有保護(hù)精子DNA完整性，使DNA免受損傷的作用。但是，在正常和不育男性精液中，均存在一定程度的精子DNA損傷。有研究報(bào)道,精子DNA損傷會(huì)對(duì)自然生育和輔助生殖技術(shù)治療結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響，并與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)。自然受孕過(guò)程中，DNA受損的精子幾乎不可能與卵子成功結(jié)合并完成受精。研究表明，DNA損傷程度與自然受孕率呈顯著負(fù)相關(guān)，如果男性精子DNA損傷率>30% ，則自然生育的可能性幾乎為0[10]。精子DNA損傷的機(jī)制尚不明確，可能是多種因素共同作用的結(jié)果。例如：精子發(fā)生過(guò)程中染色質(zhì)組裝異常，精子在發(fā)生及生殖道轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中遭受毒物和氧化應(yīng)激的損傷以及精子細(xì)胞異常凋亡等。精子DNA損傷分析是比傳統(tǒng)精液常規(guī)分析參數(shù)更穩(wěn)定、更敏感地預(yù)測(cè)男性生育能力的指標(biāo)。精子DNA完整度分析區(qū)別不育和生育能力正常的特異度為89.4%，敏感度為96.9%，這提示精子染色質(zhì)或DNA完整性可能是精子質(zhì)量的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，作為精子質(zhì)量臨床評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)具有優(yōu)越的可行性[11]。

高溫誘發(fā)生精細(xì)胞凋亡的機(jī)制十分復(fù)雜，不僅涉及溫度過(guò)高直接導(dǎo)致陰囊、睪丸的熱調(diào)節(jié)能力失效，睪丸內(nèi)溫度升高，使得睪丸內(nèi)生精細(xì)胞漿膜及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外各種信號(hào)的傳導(dǎo)異常及代謝障礙；同時(shí)可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞的損傷及細(xì)胞間信息物質(zhì)的變化，這些改變均可能使得生精細(xì)胞凋亡從而引起生精功能障礙。高溫環(huán)境下溫度一方面直接作用于睪丸，造成睪丸內(nèi)微環(huán)境、代謝和生化情況的改變，使生精細(xì)胞退化變性、脫落、凋亡增加，精子產(chǎn)生受到抑制，精子質(zhì)量和活動(dòng)能力下降;另一方面直接或間接地作用于附屬性腺如附睪等，使精子失去成熟的機(jī)會(huì)[11]，從而進(jìn)一步影響精子的受精能力，導(dǎo)致不育的發(fā)生。

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(2015-05-25收稿)(王一伊編輯)

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