胡飛，胡本進(jìn)，李昌春，周子燕，徐麗娜，李瑞雪

(1．安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，安徽 合肥 230031;2．安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，安徽 合肥 230031)

油茶Camellia oleifera Abel．是我國(guó)南方重要的經(jīng)濟(jì)林樹種，在長(zhǎng)江流域、西南地區(qū)、華南各地有廣泛栽培。油茶炭疽病病原菌為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz．，發(fā)病具有鮮明的季節(jié)性，果實(shí)、葉片均可侵染發(fā)病，在湖南、安徽等油茶主要分布區(qū)發(fā)生普遍，引起嚴(yán)重落果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株衰亡，造成油茶籽實(shí)減產(chǎn)10%～30%，重病區(qū)減產(chǎn)40%～50%［1-4］。目前國(guó)內(nèi)主要采用化學(xué)藥劑防治油茶炭疽病，百菌清、波爾多液、退菌特、甲基硫菌靈、葉斑凈(30%苯甲·丙環(huán)唑)［5-7］等效果較好。但是化學(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期使用導(dǎo)致大量農(nóng)藥殘留，誘發(fā)抗藥性，降低茶油質(zhì)量，同時(shí)也污染了生態(tài)環(huán)境，因此發(fā)展高效穩(wěn)定的生物農(nóng)藥是油茶行業(yè)的趨勢(shì)和方向。利用拮抗微生物防治油茶炭疽病的報(bào)道較多，趙秀云［8］等分離的解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生抗菌脂肽對(duì)油茶炭疽病具有較好的控制作用;周國(guó)英［9-11］等發(fā)現(xiàn)拮抗鏈霉菌F10能影響油茶炭疽病菌菌絲正常生長(zhǎng)和分生孢子的萌發(fā)，內(nèi)生枯草芽胞桿菌Y13能誘導(dǎo)油茶相關(guān)抗性酶活性的提高，同時(shí)對(duì)油茶炭疽病也具有較好的防治效果。多粘類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa具有植病防治和促生作用，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)已將其列為可商業(yè)應(yīng)用的微生物，常用于防治植物青枯病、枯萎病、黃萎病等，國(guó)內(nèi)利用多粘類芽胞桿菌開發(fā)出的生物農(nóng)藥康地雷得對(duì)植物枯萎病有較好防效［12-13］。近2 a發(fā)現(xiàn)多粘類芽胞桿菌對(duì)水稻稻瘟?。?4］、小麥根腐?。?5］、煙草黑脛病［16］、紅辣椒疫?。?7］等都具有抑制作用，但防治油茶炭疽病研究尚未見報(bào)道。作者以多粘類芽胞桿菌DN-1為試驗(yàn)藥劑，測(cè)定對(duì)油茶炭疽病菌的孢子萌發(fā)的影響及其抑菌率，通過林間防治試驗(yàn)探索多粘類芽胞桿菌防治油茶炭疽病的可行性和實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 多粘類芽胞桿菌DN-1，于青島海域海泥中分離(Genebank登錄號(hào):KM891591)，由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所保存。

油茶炭疽病病原菌菌株YTJ-1，YTJ-2，YTJ-7，YTJ-14，由安徽皖南地區(qū)油茶林病葉中分離并鑒定，經(jīng)轉(zhuǎn)接、純化培養(yǎng)后供試。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA［18］培養(yǎng)基用于病原菌培養(yǎng)、保存和對(duì)峙試驗(yàn);LB［19］培養(yǎng)基用于DN-1菌株活化;不加瓊脂的PD培養(yǎng)液用于病原菌孢子懸液及DN-1菌株種子液制備;液體發(fā)酵培養(yǎng)基［20］用于DN-1菌株液體發(fā)酵。

1.2 油茶炭疽病菌孢子懸浮液制備將4株油茶炭疽病菌接種于PDA培養(yǎng)基平板上，30℃下培養(yǎng)7 d，加入無菌水從平板上洗脫孢子，以4層滅菌紗布過濾制成孢子懸浮液，稀釋成相同濃度備用。

1.3多粘類芽胞桿菌DN-1不同芽胞濃度發(fā)酵液制備將經(jīng)LB培養(yǎng)基活化后的DN-1接入液體種子培養(yǎng)基(PD)中，培養(yǎng)24 h獲得種子液，然后按接種量5%轉(zhuǎn)至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)72 h后獲得發(fā)酵母菌液。取適量發(fā)酵菌液用無菌蒸餾水配置成不同濃度:10，20，40，80，160億芽胞/L。于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 多粘類芽胞桿菌DN-1對(duì)4株油茶炭疽病菌株孢子萌發(fā)的影響試驗(yàn)采用凹玻片法。取無菌凹玻片，先加入1%葡萄糖無菌液、再加入4株油茶炭疽病菌的孢子懸浮液20μL，最后加入不同芽胞濃度的多粘類芽胞桿菌DN-1的發(fā)酵液20μL或百菌清(2 g/L)、30%苯甲·丙環(huán)唑(0．12 g/L)藥液，蓋上蓋玻片，放入鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中于28℃下培養(yǎng)24 h，檢查孢子萌發(fā)情況(當(dāng)孢子芽管長(zhǎng)度大于孢子的短半徑時(shí)即視為萌發(fā))，每個(gè)濃度重復(fù)4次，記錄孢子萌發(fā)情況，計(jì)算抑制率。

1.5 多粘類芽胞桿菌DN-1對(duì)4株油茶炭疽病菌株抑菌率測(cè)定采用紙碟法［21］測(cè)試不同芽胞濃度DN-1的抑菌活性。在PDA培養(yǎng)基的平板中央放置1塊油茶炭疽病菌餅(直徑0．3 cm)，其周圍均勻放置4個(gè)濕潤(rùn)的紙碟(直徑0．3 cm)，5個(gè)芽胞濃度及百菌清、30%苯甲·丙環(huán)唑藥液各取50μL涂抹其上，28℃下培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)4次，以不放置紙碟的處理作對(duì)照。待對(duì)照的菌落將長(zhǎng)滿平板時(shí)，用卡尺測(cè)量菌落直徑(cm)。每個(gè)菌落用十字交叉法垂直測(cè)量直徑各1次，取其平均值，以油茶炭疽病病原菌的生長(zhǎng)速度計(jì)算抑菌率。

1.6 林間防治試驗(yàn)試驗(yàn)地設(shè)在舒城縣湯池鎮(zhèn)、舒茶鎮(zhèn)兩地油茶園區(qū)。5年生以上茶樹，樹高2～4 m，行間距2．0～2．5 m。在油茶炭疽病發(fā)病初期和高峰期各噴藥2次。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)芽胞濃度(終濃度，667 m2用水量50 L)，設(shè)百菌清(2 g/L)、30%苯甲·丙環(huán)唑(0．12 g/L)、清水3個(gè)對(duì)照(清水)，每個(gè)處理為10株，4次重復(fù)，共8個(gè)處理，樹冠噴施藥液。試驗(yàn)期間無噴施其它防治油茶炭疽病類藥劑，無異常天氣出現(xiàn)。油茶炭疽病發(fā)病初期防治試驗(yàn)于2014年4月15日、25日各施藥1次，此時(shí)油茶炭疽病開始出現(xiàn);發(fā)病高峰期防治試驗(yàn)于7月5日、15日各施藥1次。兩次試驗(yàn)于第2次施藥后30 d檢查葉片油茶炭疽病的病情等級(jí)和防治效果［22］。

1.7 數(shù)據(jù)處理用Spass19．0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并比較各處理的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 多粘類芽胞桿菌DN-1發(fā)酵液對(duì)孢子萌發(fā)的影響不同芽胞濃度多粘類芽胞桿菌DN-1發(fā)酵液對(duì)4株油茶炭疽病菌孢子萌發(fā)都有抑制作用。其對(duì)孢子萌發(fā)抑菌率與芽胞濃度呈正相關(guān)(見表1)，其中當(dāng)濃度為(10～160)億芽胞/L時(shí)對(duì)4株油茶炭疽病菌菌株的孢子萌發(fā)抑菌率41．50%～88．75%，高低濃度處理間差異極顯著。當(dāng)DN-1發(fā)酵液濃度為160億芽胞/L，孢子抑制率87%以上;與百菌清處理差異不顯著，低于30%苯甲·丙環(huán)唑處理。

表1 多粘類芽胞桿菌DN-1對(duì)4株油茶炭疽病菌的孢子萌發(fā)抑制率 %

2.2 多粘類芽胞桿菌DN-1發(fā)酵液抑菌率測(cè)定

抑菌率試驗(yàn)再次表明多粘類芽胞桿菌DN-1對(duì)4株油茶炭疽病菌生長(zhǎng)有明顯抑制作用(見表2)。10億芽胞/L對(duì)4株油茶炭疽病菌抑菌率35．81%～47．78%，隨著處理濃度的增加，抑菌率隨之增強(qiáng)，160億芽胞/L的抑菌率75．10%～77．56%，5個(gè)濃度處理間抑菌率差異顯著;DN-1發(fā)酵液160億芽胞/L抑菌率與百菌清處理相當(dāng)，差異不顯著;而顯著低于30%苯甲·丙環(huán)唑處理。

表2 多粘類芽胞桿菌DN-1對(duì)油茶炭疽病菌的抑菌作用

2.3 林間防治2014年4—7月在湯池鎮(zhèn)、舒茶鎮(zhèn)兩地油茶園區(qū)進(jìn)行的林間防治試驗(yàn)表明，多粘類芽胞桿菌DN-1對(duì)油茶炭疽病都具有較好的林間防效(表3，4)，當(dāng)濃度高于80億芽胞/L時(shí)，兩地不同施藥時(shí)期的林間防效較穩(wěn)定。

在湯池鎮(zhèn)，DN-1濃度為(10～160)億芽胞/L時(shí)，發(fā)病初期施藥后30 d調(diào)查的防效29．80%～68．91%，160億芽胞/L時(shí)防效與對(duì)照藥劑百菌清無明顯差異，但低于對(duì)照藥劑30%苯甲·丙環(huán)唑，差異不明顯;發(fā)病高峰期施藥后30 d調(diào)查的防效26．61%～50．20%，160億芽胞/L濃度與30%苯甲·丙環(huán)唑處理間防效差異極顯著。在油茶炭疽病發(fā)病高峰期施藥的林間防效顯著低于發(fā)病初期施藥。

在舒茶鎮(zhèn)，DN-1濃度為(10～160)億芽胞/L時(shí)，發(fā)病初期施藥后30 d調(diào)查的防效31．11%～67．55%，160億芽胞/L濃度林間防效低于30%苯甲·丙環(huán)唑處理，差異不顯著;發(fā)病高峰期施藥后30 d調(diào)查的防效21．95%～52．66%，160億芽胞/L濃度處理低于30%苯甲·丙環(huán)唑的防效，差異顯著。在油茶炭疽病發(fā)病高峰期施藥的林間防效也顯著低于發(fā)病初期施藥。

表3 多粘類芽胞桿菌DN-1對(duì)油茶炭疽病菌的林間藥后30 d防治效果(湯池鎮(zhèn))

表4 多粘類芽胞桿菌DN-1對(duì)油茶炭疽病菌的林間藥后30 d防治效果(舒茶鎮(zhèn))

3 討論

室內(nèi)和林間防治試驗(yàn)研究結(jié)果表明多粘類芽胞桿菌DN-1對(duì)油茶炭疽病能起到較好的防治作用，與報(bào)道的枯草芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌一樣均可用于油茶炭疽病林間防治。當(dāng)終濃度達(dá)160億芽胞/L時(shí)，DN-1對(duì)4株油茶炭疽病菌孢子抑制率87%以上，室內(nèi)抑菌率75%以上;在油茶炭疽病發(fā)病初期施藥林間防效70%左右，而在發(fā)病高峰期施藥僅有50%左右。這說明多粘類芽胞桿菌DN-1具有林間防治油茶炭疽病的應(yīng)用價(jià)值，這不僅拓展了多粘類芽胞桿菌的抑菌譜，也為在油茶綠色防控方面提供了新的菌種資源。

DN-1各濃度處理抑菌率均低于孢子抑制率，這可能與多粘類芽胞桿菌芽胞及發(fā)酵液直接與分生孢子作用有關(guān)，能較強(qiáng)的抑制分生孢子萌發(fā)。當(dāng)多粘類芽胞桿菌孢子濃度達(dá)160億孢子/L時(shí)，在油茶炭疽病發(fā)病初期施藥可以起到較好的控制作用，與百菌清防效接近，而在發(fā)病高峰期施藥防效明顯下降，兩地林間防治效果穩(wěn)定。這可能是在油茶炭疽病發(fā)病初期即病情指數(shù)較低時(shí)，有利于多粘類芽胞桿菌DN-1競(jìng)爭(zhēng)占位，快速誘導(dǎo)油茶自身抗病系統(tǒng)啟動(dòng)，從而抵擋病原菌的進(jìn)一步侵入，也可能是發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)能在發(fā)病初期較好的抑制病原菌擴(kuò)展。本次林間試驗(yàn)證明多粘類芽胞桿菌防治油茶炭疽病，應(yīng)在發(fā)病初期施藥，這與生物農(nóng)藥預(yù)防為先的施用方式相符合。

多粘類芽胞桿菌作用機(jī)制多樣，既有抗菌多肽、蛋白等起作用，也可通過菌體與病原菌在生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)生存空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可以與植物相互作用引起植物體內(nèi)一系列生理生化變化，進(jìn)而使植物對(duì)病害產(chǎn)生抗性［23］。本研究雖然證明了多粘類芽胞桿菌DN-1對(duì)油茶炭疽病的生防作用，但對(duì)具體起作用的是活菌體還是發(fā)酵液中的具體活性物質(zhì)未做分析，對(duì)防治機(jī)理也未涉及，以后需要對(duì)其在油茶葉片上的定殖動(dòng)態(tài)［24］、發(fā)酵液中活性物質(zhì)分析［25］、以及與油茶抗病性相關(guān)酶活的生理指標(biāo)測(cè)定做進(jìn)一步完善，進(jìn)而為研制新型油茶炭疽病生物防治藥劑奠定基礎(chǔ)。

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