常曉波

三二〇一醫(yī)院 漢中 723000

癲癇是一種反復(fù)發(fā)作的慢性短暫性的腦功能失調(diào)的綜合征，以反復(fù)的神經(jīng)元異常放電為主要特征［1］。癲癇是神經(jīng)內(nèi)科的常見(jiàn)病，其發(fā)病率僅次于卒中。癲癇的治療主要是控制癇性發(fā)作，目前以藥物控制為主，臨床根據(jù)癲癇類(lèi)型選擇藥物，應(yīng)不間斷服藥，主張單一用藥，若效果不理想可以?xún)煞N及以上藥物聯(lián)合應(yīng)用［2］。近年來(lái)重要制劑在癲癇控制中的應(yīng)用得到較為廣泛的關(guān)注，但有效的藥物報(bào)道較少［3］。本次研究應(yīng)用60只大鼠作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)比含維生素組合定癇膠囊與定癇膠囊加服維生素組合用于癲癇控制的療效。

1 材料

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用60只健康的雄性Wistar作為實(shí)驗(yàn)材料，體質(zhì)量180～200g，平均（189．2±7．4）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)14-0122。

1．2 藥物 戊四氮（Pentetrazole，PTZ，北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20130511）。菖連定癇膠囊（保定世臣癲癇病醫(yī)院，批號(hào)：20120211）；維生素：谷維素（上海青平藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20121103），維生素C（四川金藥師制藥有限公司，批號(hào)：20131105）；維生素B6（浙江天新藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20130701），磷酸氫鈣（南寧康諾生化制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：201200706）。含維生素組合菖連定癇膠囊（保定世臣癲癇病醫(yī)院，批號(hào)：20130207），維生素組合：谷維素10mg／kg，維生素B62mg／kg，維生素C 66 mg／kg，磷酸氫鈣66mg／kg。丙戊酸鈉（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：20130211）。

2 方法

2．1 模型構(gòu)造 采用戊四氮腹腔注射（ig）法構(gòu)建大鼠的癲癇模型：每天上午9：00～11：00時(shí)給大鼠注射PTZ，劑量為30～40mg／kg。對(duì)于出現(xiàn)持續(xù)性的Ⅵ級(jí)癲癇發(fā)作的個(gè)體立即注射1mL 7%的水合氯醛搶救。

2．2 分組及用藥 60只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為5組：A組（空白對(duì)照組）12只，不注射PTZ和抗癲癇藥物；B～E 組的48只大鼠均應(yīng)用PTZ構(gòu)建癲癇大鼠模型：B組（模型對(duì)照組）12只，灌服生理鹽水；C組（丙戊酸鈉組）12只，大鼠灌服丙戊酸鈉控制癲癇發(fā)作，劑量為15．75mg／kg；D 組（定癇膠囊＋維生素組合）灌服400 mg／kg的菖連定癇膠囊和維生素；E組（含維生素組合菖連定癇膠囊）灌服含維生素組合菖連定癇膠囊，劑量為500mg／kg。研究期間均采用普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

2．3 大鼠海馬區(qū)Bcl-2的表達(dá)水平檢驗(yàn)

2．3．1 大鼠海馬組織的獲取：用水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，打開(kāi)胸腔，經(jīng)升主動(dòng)脈快速靜滴200mL 生理鹽水，繼而注射200mL 的4%的多聚甲醛，先快速灌注，再緩慢靜滴，然后取大鼠腦組織。在大腦的視交叉與視乳頭切取冠狀組織，剝離左右海馬。

2．3．2 PCR 檢測(cè)：大鼠的Bcl-2引物由上海生物工程公司合成，參照物選擇GAPDH，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。DNA 模板5μL，PCR 緩沖液2μL，dNTP 2μL，MgCl 2 2μL，引物1（upward）0．5μL，引物2（downward）0．5μL，dH2O 7．75μL，Tag 0．25μL，共20μL 配成反應(yīng)體系。94℃變性5min，94℃1min，5℃1min，72℃1min，順序循環(huán)35次，72 ℃延伸5min，產(chǎn)物4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠板上電泳，在凝膠自動(dòng)成像儀下成像，觀察、判定結(jié)果。2．3．3 Western blot法：使用Western blot檢測(cè)大鼠海馬組織中Bcl-2的表達(dá)水平：將組織剪開(kāi)，加入胰蛋白酶消化，離心后收集細(xì)胞。使用預(yù)冷PBS洗滌將細(xì)胞沖洗2遍，裂解細(xì)胞后獲取總蛋白。將蛋白定量后經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、切膜后加入兔抗鼠Bcl-2抗體（上海億欣生物科技有限公司），4℃孵育過(guò)夜，洗滌后加入二抗（羊抗兔抗體），室溫孵育1．5h后洗膜，ECL試劑盒曝光顯影。

2．4 觀察指標(biāo) （1）比較4組癲癇大鼠的驚厥發(fā)生率和病死率。（2）觀察大鼠的癲癇發(fā)作級(jí)別的變化，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［4］：未表現(xiàn)出行為發(fā)作為0 級(jí)，出現(xiàn)節(jié)律性點(diǎn)頭或頭部抽搐為1級(jí)，出現(xiàn)陣攣性咀嚼者為2級(jí)，出現(xiàn)前置陣攣性抽搐和頭部震顫為3級(jí)，上身直立者為4級(jí)，大鼠跌倒者為5級(jí)，出現(xiàn)強(qiáng)直性驚厥者為6級(jí)。（3）比較實(shí)驗(yàn)前、用藥1周、2周和4周后大鼠的驚厥持續(xù)時(shí)間和體質(zhì)量的變化。（4）比較5組大鼠4周后海馬區(qū)Bcl-2的表達(dá)水平變化。

2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15．0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s表示，采用t檢驗(yàn)和重復(fù)測(cè)量方差分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3．1 癲癇大鼠的驚厥發(fā)生率和病死率比較 4周后4組癲癇大鼠的驚厥發(fā)生率和病死率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見(jiàn)表1。

表1 大鼠驚厥發(fā)生率和病死率比較 ［n（%）］

3．2 用藥前后大鼠癲癇發(fā)作級(jí)別的變化比較 與用藥前相比，C～E組大鼠的癲癇發(fā)作級(jí)別均明顯減輕（P＜0．05）；C～E組大鼠用藥后的癲癇發(fā)作級(jí)別較B 組明顯減輕（P＜0．05）。見(jiàn)表2。

表2 用藥前后大鼠的癲癇發(fā)作級(jí)別的變化 （±s）

表2 用藥前后大鼠的癲癇發(fā)作級(jí)別的變化 （±s）

組別 n 癲癇發(fā)作級(jí)別用藥前 用藥后B組12 4．1±1．2 3．8±0．9 C組 12 4．2±1．3 1．9±0．4 D 組 12 4．0±1．1 2．0±0．6 E組 12 4．1±1．4 1．8±0．5組間 F＝5．73，P＜0．05時(shí)間 F＝6．12，P＜0．05組間＊時(shí)間 F＝2．07，P＞0．05

3．3 含維生素組合定癇膠囊與定癇膠囊加服維生素組合對(duì)驚厥持續(xù)時(shí)間和體質(zhì)量的影響 與用藥前相比，C～E 組大鼠的驚厥持續(xù)時(shí)間均明顯縮短（P＜0．05）；C～E組大鼠用藥后的驚厥持續(xù)時(shí)間較B組明顯縮短（P＜0．05）；與用藥前相比，C～E組大鼠的體質(zhì)量均明顯增加（P＜0．05）；C～E組大鼠用藥后的體質(zhì)量較B組明顯增加（P＜0．05）。見(jiàn)表2。

表3 大鼠癲癇發(fā)作時(shí)間和體質(zhì)量變化比較 （±s）

表3 大鼠癲癇發(fā)作時(shí)間和體質(zhì)量變化比較 （±s）

組別 n 驚厥持續(xù)時(shí)間（min） 體質(zhì)量（g）用藥前 1周后 2周后 4周后 用藥前 1周后 2周后 4周后B組 12 44．12±9．96 43．15±7．82 42．12±8．01 41．02±8．82 189．23±7．91 198．12±6．98 202．78±9．11 207．23±10．35 C組 12 45．32±10．02 32．14±5．83 28．85±4．02 14．18±2．15 191．82±8．17 218．23±10．25 252．25±15．98 285．12±24．87 D組 12 45．11±9．08 34．17±6．02 30．11±4．78 16．15±2．34 188．79±7．82 215．87±9．95 248．97±14．89 278．98±25．02 E組 12 45．16±9．45 32．08±5．65 27．31±4．52 13．97±2．18 192．13±7．23 220．94±11．24 255．45±17．32 291．82±27．13組間 F＝9．12，P＜0．05 F＝15．32，P＜0．05時(shí)間 F＝8．78，P＜0．05 F＝11．08，P＜0．05組間＊時(shí)間 F＝2．83，P＜0．05 F＝3．52，P＜0．05

3．4 大鼠海馬區(qū)Bcl-2的mRNA 水平和蛋白水平檢測(cè) 4周后5組大鼠海馬區(qū)的Bcl-2的mRNA 水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4．72，P＜0．05），Bcl-2蛋白水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3．97，P＜0．05）。見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 大鼠海馬區(qū)Bcl-2的蛋白質(zhì)水平比較

圖2 大鼠海馬區(qū)Bcl-2的mRNA 水平比較

4 討論

癲癇是神經(jīng)元異常放電引起的慢性的反復(fù)發(fā)作的腦功能失調(diào)綜合征，戊四氮腹腔注射是目前較為常用的誘導(dǎo)癲癇動(dòng)物模型的方法［5］。臨床上的癲癇控制以藥物為主，盡管西藥控制癲癇盡管療效強(qiáng)、見(jiàn)效快，但不良反應(yīng)較強(qiáng)，臨床應(yīng)用具有一定的局限性；研究發(fā)現(xiàn)，中藥制劑用于癲癇控制長(zhǎng)期療效較為穩(wěn)定，近些年來(lái)得到較為廣泛的關(guān)注［6］。

中藥制劑治療癲癇的關(guān)鍵在于調(diào)整患者的功能狀態(tài)。維生素C可以有效對(duì)抗自由基，有效避免神經(jīng)元的氧化破壞，同時(shí)可以增加細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度［7-8］。維生素B6的缺乏可導(dǎo)致腦內(nèi)谷氨酸脫羧酶的活性下降，誘發(fā)癲癇發(fā)作［9-10］。中藥制劑和維生素聯(lián)合應(yīng)用在癲癇的控制中具有一定的療效。本次研究中，通過(guò)腹腔注射，筆者成功構(gòu)建了48只大鼠的癲癇模型，用藥4周后，灌服丙戊酸鈉、定癇膠囊＋維生素組和含維生素組合大鼠的驚厥發(fā)生率和病死率明顯低于模型對(duì)照組大鼠，且癲癇發(fā)作級(jí)別、驚厥持續(xù)時(shí)間和體質(zhì)量均明顯改善，3組服藥的大鼠的療效相當(dāng)，說(shuō)明定癇膠囊＋維生素組和含維生素組合在癲癇控制中療效較為明顯，與丙戊酸鈉相當(dāng)。癲癇的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，研究顯示，癲癇持續(xù)發(fā)作狀態(tài)可以導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷與凋亡，Bcl-2對(duì)于海馬內(nèi)損傷神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用，Bcl-2的表達(dá)可以增加細(xì)胞對(duì)多數(shù)DNA 有害因子的抵抗能力［11-13］。與空白對(duì)照組相比，48只癲癇大鼠的Bcl-2表達(dá)水平均明顯下降，說(shuō)明癲癇大鼠的Bcl-2表達(dá)水平下降。服用丙戊酸鈉、定癇膠囊＋維生素組和含維生素組合大鼠的Bcl-2表達(dá)水平高于模型大鼠組。說(shuō)明定癇膠囊＋維生素組和含維生素組合菖連定癇膠囊以及丙戊酸鈉均可有效對(duì)抗大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡［14-15］。

本次研究顯示，PTZ引發(fā)癲癇的大鼠在經(jīng)定癇膠囊＋維生素組和含維生素組合菖連定癇膠囊治療后，大鼠的驚厥發(fā)生率、病死率和癲癇發(fā)作級(jí)別均明顯優(yōu)于模型對(duì)照組，前2組大鼠的大腦海馬組織中的Bcl-2表達(dá)水平均明顯高于模型組大鼠，灌服定癇膠囊＋維生素組和含維生素定癇膠囊的2組大鼠的驚厥發(fā)生率、病死率、癲癇發(fā)作級(jí)別、警覺(jué)持續(xù)時(shí)間、體質(zhì)量和Bcl-2表達(dá)水平無(wú)明顯差異。綜上，中藥制劑應(yīng)用于癲癇控制療效穩(wěn)定，不良反應(yīng)較輕，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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