岳四海 郭永坤

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450007

干細(xì)胞是臨床再生替代治療極其重要的資源，干細(xì)胞移植治療多種疾病的有效性和潛能日益受到重視，有著廣闊的應(yīng)用前景［1-5］。分子影像學(xué)，特別是MR 的發(fā)展使在活體狀態(tài)下示蹤移植干細(xì)胞成為現(xiàn)實(shí)。MR 具有極其精細(xì)的組織分辨率、空間分辨率、無游離輻射和非侵襲性等特點(diǎn)，通過MR報(bào)告基因介導(dǎo)的分子成像可以監(jiān)測移植細(xì)胞的分布、動(dòng)態(tài)遷移的過程以及與宿主的整合情況。其中人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（human transferrin receptor，hTfR）報(bào)告基因在MR 分 子成像中受到高度重視和廣泛的關(guān)注［6］。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建hTfR 慢病毒表達(dá)載體，為下一步以hTfR 為報(bào)告基因的活體干細(xì)胞MR 分子成像奠定基礎(chǔ)，以期為今后臨床活體示蹤干細(xì)胞提供一種新的途徑和方法。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 質(zhì)粒和菌株：pENTR221-hTfR質(zhì)粒購于廣州復(fù)能基因有限公司；pLENTI6．3 載體由中國人民解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院楊志軍教授惠贈(zèng)；E．coli DH5a 感受態(tài)細(xì)菌購于天根生化科技（北京）有限公司；小鼠神經(jīng)干細(xì)胞胚胎來源CD1，小鼠神經(jīng)干細(xì)胞由中國人民解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院楊志軍教授惠贈(zèng)。

1．1．2 主要試劑：T4連接酶、限制性內(nèi)切酶和堿性磷酸酶購自NEB 公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；DAN Maker購自天根生化科技（北京）有限 公 司；lipofectamine 2000、Opti-MEM培養(yǎng)液、293T 細(xì)胞、B27、Neurobasal培養(yǎng)基、多聚賴氨酸均購于Sigma公司；DMEM 培養(yǎng)基、DMEM／F12（1∶1）培養(yǎng)基購于Hyclone公司；兔抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（hTfR）單克隆抗體購于Epitomics公司。

1．2 方法

1．2．1 PCR 引物的設(shè)計(jì)和合成：根據(jù)Genbank收錄的hTfR序列（BC001188）設(shè)計(jì)引物，在上游引物的5＇端加入Bamh1酶切位點(diǎn)和Kozak序列，下游引物的5＇端加入BamH1酶切位點(diǎn)。上游引物序列：5＇-CGC［GCCACC］ATGAT-GGATCAAGCTAGAGATCAGC-3＇（下劃線部分為BamH1酶切位點(diǎn)，括號(hào)內(nèi)部分為Kozak 序列）；下游引物序列：5＇-CGCTTAAAACTCATTGCAATGTCCCAAC-3 ＇（下劃線部分為BamH1酶切位點(diǎn)）。引物送北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1．2．2 PCR 擴(kuò)增hTfR 基因和膠回收：為保證基因克隆的正確率，采用具有高保真性和高擴(kuò)增效率的PfuDAN 聚合酶。以pENTR221-hTfR基因質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增hTfR。PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3min，94°C變性45s，60°C退火45s，72°C 延伸4 min，共25 個(gè) 循環(huán)，72°C 延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，按照試劑盒說明書回收目的基因。

1．2．3 重組質(zhì)粒pLENTI6．3-hTfR-IRES-EGFP的構(gòu)建：對(duì)空載體pLENTI6．3和PCR 的回收目的產(chǎn)物分別用BamH1進(jìn)行酶切，反應(yīng)條件為：37°C，4h；在酶切反應(yīng)2h時(shí)用NEB的堿性磷酸酶進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)，以減少載體自連產(chǎn)生假陽性克??；對(duì)酶切載體進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收；酶切目的片段的純化，根據(jù)PCR 清潔試劑盒說明書進(jìn)行。將去磷酸化的酶切載體和目的片段按5∶1的摩爾比例，用T4DNA 連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，4 ℃，連接過夜；次日連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E．coli DH5a感受態(tài)細(xì)菌，涂布氨芐（Amp）抗性LB平板，37 ℃搖菌過夜培養(yǎng)。

1．2．4 克隆鑒定：轉(zhuǎn)化后，挑取單菌落，用上述設(shè)計(jì)合成好的PCR 的引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測陽性菌落，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min，94變性45s，60℃退火45s，72℃延伸4 min，共25個(gè)循環(huán)，72°C 延伸10min；PCR 產(chǎn)物行1%的瓊脂糖凝膠電泳后鑒定。挑取陽性菌落接種于5mL Amp 抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃220r／min搖菌過夜培養(yǎng)；按質(zhì)粒提取試劑說明書提取質(zhì)粒，并行BamH1酶切，反應(yīng)條件為：37℃，4h，酶切產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠電泳后鑒定。酶切鑒定符合理論值的質(zhì)粒菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1．2．5 慢病毒顆粒的包裝：接種293T 細(xì)胞，次日觀察細(xì)胞密度，達(dá)到80%融合率時(shí)用制備的重組質(zhì)粒pLenti6．3-hTfR-IRES-EGFP與PLP1、PLP2、PLP-VSVG 在轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2 000下共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞。培養(yǎng)6h后，更換完全培養(yǎng)液DMEM ＋10%FBS。轉(zhuǎn)染48h后收集病毒上清，0．45μm 的濾器過濾；將病毒原液在50 000g下超速離心2 h，收集沉淀，重懸于opti-MEM 培養(yǎng)液中，取部分濃縮病毒液進(jìn)行滴度測定，其余分裝成小管保存于-80 ℃，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1．2．6 NSCs復(fù)蘇培養(yǎng)及慢病毒的感染：將凍存的細(xì)胞從液氮中取出，快速轉(zhuǎn)入到37 ℃水浴中，邊解凍，邊振蕩，待細(xì)胞解凍；將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到2倍體積的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，1 000 r／min，離心3min，去上清；神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，按1×106Cells／（6 mL·瓶）接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的第7代NSCs，接種到12孔板中培養(yǎng)3h后，每孔加入MOI值為10的病毒稀釋液，設(shè)置空載體和空白細(xì)胞作為對(duì)照組。感染12h后半量換液一次，以后每24h半量換液1次，72h后倒置熒光顯微鏡下觀察感染情況。

1．2．7 Western blot檢測TfR 蛋白的表達(dá)水平：將1×106個(gè)過表達(dá)hTfR 的NSCs用200μL×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液重懸，煮沸5～10min直接裂解，提取總蛋白，設(shè)置EGFP-NSCs組和NSCs組作為對(duì)照。各組取15μL 蛋白上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE 凝膠電泳、半干轉(zhuǎn)法將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜、5%BSA 封閉1h，兔抗人hTfR 單克隆抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體（1∶2 000），室溫孵育1h，化學(xué)熒光檢測。

2 結(jié)果

2．1 hTfR 基因的擴(kuò)增 以pENTR221-hTfR 為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，1%的瓊脂糖凝膠電泳可見1條長約2 283bp的亮帶，與理論值一致。見圖1。

2．2 重組載體酶切鑒定和測序 提取菌落陽性克隆8的質(zhì)粒，行BamH1酶切，1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示：酶切圖譜有11條長約2 283bp的亮帶。見圖2。送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。測序結(jié)果顯示：hTfR 基因序列正確，無突變或缺失。以上結(jié)果表明pLENTI6．3-hTfRIRES-EGFP 重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 hTfR PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果圖

圖2 pLENTI6．31-hTfRIRES-EGFP重組慢病毒表達(dá)載體BamH1酶切后電泳圖

2．3 hTfR 在NSCs中的熒光表達(dá) 慢病毒感染48h后可見部分細(xì)胞開始有微弱綠色熒光出現(xiàn)，其后綠色熒光逐漸增強(qiáng)，72h可見幾乎每個(gè)神經(jīng)球都有綠色熒光，部分神經(jīng)球熒光比較強(qiáng)，表明hTfR慢病毒成功高效的感染NSCs。見圖3。

圖3 hTfR 在NSCS中的熒光表達(dá)

2．4 Western blot檢測hTfR 蛋白的表達(dá)水平 目的條帶出現(xiàn)在相對(duì)分子量為90u區(qū)域附近，與理論值一致，hTfRNSC組蛋白表達(dá)量明顯高于EGFP-NSC 組和NSC 組，對(duì)照組hTfR 的表達(dá)量很低，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的hTfR 的表達(dá)水平明顯增加。見圖4。

圖4 Western blot檢測hTfR 蛋白的表達(dá)結(jié)果1．hTfR-NSC組；2．EGFP-NSC組；3．NSC組

3 討論

hTfR 是一種廣泛分布于細(xì)胞膜的跨膜糖蛋白，但其表達(dá)具有明顯的組織分布差異性，在高增殖的基底上皮細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞等有較高水平的表達(dá)，也在非增殖的細(xì)胞中表達(dá)，如腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺、睪丸細(xì)精管等。hTfR位于人的第3 號(hào)染色體，編碼區(qū)（CDS）長2 283bp。hTfR 的表達(dá)主要受細(xì)胞內(nèi)鐵的水平進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)，hTfR mRNA3＇端非編碼區(qū)存在5個(gè)連鎖作用的鐵效應(yīng)元件（five iron response elements，IRE）是hTfR 表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，這些鐵的效應(yīng)元件被2種RNA 結(jié)合的鐵調(diào)節(jié)蛋白（iron regulatory proteins，IRP）識(shí) 別，并 控 制mRNA的穩(wěn)定性［7］。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵不足時(shí)，IRP-1 結(jié) 合IRES 增加了TfR mRNA 的穩(wěn)定性，因此TfR 的mRNA 被翻譯，增加了細(xì)胞表面的TfR。

目前，干細(xì)胞活體非侵襲性示蹤的分子影像學(xué)技術(shù)主要有光學(xué)成像、核素成像和磁共振成像（MRI）等。相比其他技術(shù)，MRI有著極其精細(xì)的空間分辨率和組織分辨率，對(duì)深層組織成像無困難，且無電離輻射，已廣泛用于臨床；對(duì)于移植的干細(xì)胞，MRI還可以獲得移植周圍組織的解剖和生理信息，包括移植灶周圍的水腫和炎癥，這些為臨床醫(yī)生提供了更多的信息，有助于了解細(xì)胞移植治療的各個(gè)方面［8］。以報(bào)告基因?yàn)榛A(chǔ)的MRI具有MR 信號(hào)不會(huì)或很少受干細(xì)胞分裂的影響，且報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物可以反映干細(xì)胞的功能和活力等優(yōu)點(diǎn)［9-10］。目前，用于MRI的報(bào)告基因有β-半乳糖苷酶、酪氨酸酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、鐵蛋白、富含賴氨酸蛋白等，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的報(bào)告基因應(yīng)用最為廣泛［11］。hTfR 是細(xì)胞膜上的受體蛋白，與特異性配體轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）結(jié)合介導(dǎo)Fe的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。在MR 的分子影像中，將hTfR 基因?qū)敫杉?xì)胞，干細(xì)胞過表達(dá)hTfR，與Tf連接的磁性氧化鐵即Tf的分子探針，通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。這樣干細(xì)胞內(nèi)磁性氧化鐵納米顆粒的蓄積，實(shí)現(xiàn)了MRI信號(hào)的逐步放大，提高了對(duì)干細(xì)胞信號(hào)的敏感性，從而獲得MR T2WI上特征性的低信號(hào)［12］。Wang 等［13］應(yīng)用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）作為報(bào)告基因，轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)的超小順磁性氧化鐵納米顆粒的復(fù)合物（Tf-USPIO）作為MR 的報(bào)告探針，對(duì)小鼠MDA-MB-231 細(xì)胞的乳腺癌的動(dòng)物模型靜脈注射Tf-USPIO 分子探針，發(fā)現(xiàn)腫瘤MR T2的弛豫時(shí)間比較對(duì)照組顯著縮短，表明轉(zhuǎn)鐵蛋白受體為報(bào)告基因成功進(jìn)行了MR活體分子成像，可以對(duì)內(nèi)皮抑制素基因的表達(dá)和治療進(jìn)行了活體動(dòng)態(tài)監(jiān)測。目前的研究表明，TfR 報(bào)告基因介導(dǎo)的Tf-USPIO 分子探針的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和蓄積，能夠?qū)fR 進(jìn)行MR基因顯像和示蹤，并可以檢測TfR 的表達(dá)水平［14-16］。

與其他病毒載體系統(tǒng)相比，慢病毒可以穩(wěn)定高效的感染分裂和非分裂細(xì)胞，無明顯免疫反應(yīng)，同時(shí)能夠轉(zhuǎn)染廣泛的組織等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體［17-20］。因此通過慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，使報(bào)告基因在靶細(xì)胞穩(wěn)定的表達(dá)，從而達(dá)到長期檢測的目的。本實(shí)驗(yàn)中，只擴(kuò)增了hTfR 編碼區(qū)2 283bp，去除了細(xì)胞內(nèi)Fe對(duì)的調(diào)控。采用高保真的Pfu DNA 聚合酶擴(kuò)增目的片段，減少了堿基的錯(cuò)配或突變。對(duì)于重組質(zhì)粒的鑒定，首先進(jìn)行了簡單快速的菌落PCR 初步篩選鑒定，用初步篩選的陽性克隆，搖菌、小提質(zhì)粒、酶切鑒定和基因測序，結(jié)果證實(shí)pLENTI6．3-hTfR-IRES-EGFP重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建成功。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用慢病毒包裝系統(tǒng)包裝出含有hTfR 基因的高滴度病毒，高效地感染到NSCs中。Western blot分蛋白證實(shí)了hTfR 的過表達(dá)。

干細(xì)胞低水平表達(dá)hTfR，且受細(xì)胞內(nèi)IRE 的負(fù)反饋調(diào)節(jié)［8］，無法實(shí)現(xiàn)以hTfR 為標(biāo)記物的MR 分子影像成像。因此，如果利用轉(zhuǎn)基因的方法，將hTfR 基因?qū)敫杉?xì)胞內(nèi)，使其過表達(dá)hTfR，因而干細(xì)胞可攝取較多的磁性氧化鐵納米顆粒，使其在MR T2WI信號(hào)特異性減低，從而達(dá)到對(duì)移植后干細(xì)胞長期無侵襲性的活體示蹤。我們構(gòu)建的pLENTI6．3-hTfR-IRES-EGFP重組慢病毒載體，還帶有EGFP 報(bào)告基因，通過組織冰凍切片的熒光顯微鏡檢測，進(jìn)行離體狀態(tài)下的EGFP報(bào)告基因熒光成像，從而達(dá)到活體和離體檢測的相互印證。本實(shí)驗(yàn)為下一步進(jìn)行NSCs體外、體內(nèi)的MR 分子成像研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］Giralt SA，Horowitz M，Weisdorf D，et al．Review of stem-cell transplantation for myelodysplastic syndrmoes in older patients in the context of the Decision Memo for Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Myelodysplastic Syndrome emanating from the Centers for Medicare and Medicaid Services［J］．J Clin Oncol，2011，29（5）：566-572．

［2］Sharp J，F(xiàn)rame J，Siegenthaler M，et al．Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants improve recovery after cervical spinal cord injury［J］．Stem Cells，2010，28（1）：152-163．

［3］Kisseleva T，Gigante E，Brenner DA．Recent advances in liver stem cell therapy［J］．Curr Opin Gastroenterol，2010，26（4）：395-402．

［4］Couzin J．Biotechnology．Celebration and concern over U．S．Trial of embryonic stem cells［J］．Science，2009，323（5 914）：568．

［5］Gonzales C，Pedrazzini T．Progenitor cell therapy for heart disease［J］．Exp Cell Res，2009，315（18）：3 077-3 085．

［6］Gilad AA，Keren Z，Michael T，et al．MR reporter genes［J］．J Nucl Med，2008，49（12）：1 905-1 908．

［7］Zhang CY，Lu J，Tsourkas A．Iron chelator-based amplification strategy for improved targeting of transferrin receptor with SPIO［J］．Cancer Biology ＆Therapy，2008，7（6）：889-895．

［8］Cromer Berman SM，Walczak P，Bulte JW．Tracking stem cells using magnetic nanoparticles［J］．Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol，2011，3（4）：343-355．

［9］Rodriguez-Porcel M．In Vivo Imaging and Monitoring of Transplanted Stem Cells：Clinical Applications［J］．Curr Cardiol Rep，2010，12（1）：51-58．

［10］Liu J，Cheng EC，Long RC，et al．Noninvasive Monitoring of Embryonic Stem Cells In Vivo with MRI Transgene Reporter［J］．Tissue Eng Part C Methods，2009，15（4）：739-747．

［11］Liu J，Cheng EC，Long RC，et al．Noninvasive Monitoring of Embryonic Stem Cells In Vivo with MRI Transgene Reporter［J］．Tissue Eng Part C Methods，2009，15（4）：739-747．

［12］Moore A，Josephson L，Bhorade RM，et al．Human transferrin receptor gene as a maker gene for MR imaging［J］．Radiology，2001，221（1）：244-250．

［13］Wang K，Wang KZ，Shen BZ，et al．MR Reporter Gene Imaging of Endostatin Expression and Therapy［J］．Mol Imaging Biol，2010，12（5）：520-529．

［14］Thorek DL，Tsourkas A．Size，charge and concentration dependent uptake of iron oxide particles by non-phagocytic cells［J］．Biomaterials，2008，29（26）：3 583-3 590．

［15］Waerzeggers Y，Monfared P，Viel T，et al．Methods to monitor gene therapy with molecular imaging［J］．Methods，2009，48（2）：146-160．

［16］Nakase I，Gallis B，Takatani-Nakase T，et al．Transferrin receptor dependent cytotoxicity of artemisinin-transferrin conjugates on prostate cancer cells and induction of apoptosis［J］．Cancer Lett，2009，274（2）：290-298．

［17］Dropulic B．Lentiviral Vectors：Their Molecular Design，Safety，and Use in Laboratory and Preclinical Research［J］．Hum Gene Ther，2011，22（6）：649-657．

［18］Warlich E，Kuehle J，Cantz T，et al．Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming［J］．Mol Ther，2011，19（4）：782-789．

［19］Lin Y，Cheung P，Roth JC，et al．Imaging stem cell derived persistent foci after in vivo selection of lentiviral MGMTP140Ktransduced murine bone marrow cells［J］．Mol Ther，2011，19（7）：1 342-1 352．

［20］Pomper MG，Hammond H，Yu X，et al．Serial imaging of human embryonic stem-cell engraftment and teratoma formation in live mouse models［J］．Cell Res，2009，19（3）：370-379．