任素賢，艾鵬飛，宋層孝，陳文靜，宋建軍(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是體外酶促合成反應(yīng)、重復(fù)擴(kuò)增DNA序列的一種方法，可以使目標(biāo)DNA片段在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增出千萬(wàn)倍。自1983年P(guān)CR技術(shù)建立以來(lái)，由于其超強(qiáng)的擴(kuò)增能力，且可與其他分子生物學(xué)方法相結(jié)合，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，成為發(fā)展和應(yīng)用最為迅猛的分子生物學(xué)技術(shù)之一。隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，目前已開(kāi)發(fā)出了一系列適用于不同研究目的的PCR新技術(shù)，如反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光實(shí)時(shí)定量PCR、差異顯示PCR、著色互補(bǔ)PCR、巢式PCR、免疫PCR、多重PCR等［1－3］。

多重PCR(Multiplex－PCR)技術(shù)因?yàn)榫哂懈咝Э旖?、高度特異敏感、?shí)驗(yàn)成本低、實(shí)驗(yàn)進(jìn)程快等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。自1988年Chamberian等［4］首先報(bào)道了用多重PCR診斷杜式肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)以來(lái)，多重PCR技術(shù)迅速在動(dòng)物、微生物以及人類研究方面得到廣泛應(yīng)用［5－6］。然而，多重PCR技術(shù)在植物生物學(xué)研究方面起步較晚，研究與應(yīng)用相對(duì)較少［7］。目前，隨著對(duì)多重PCR技術(shù)認(rèn)識(shí)的加深和研究的深入，越來(lái)越多的植物學(xué)家們熱衷于研究多重PCR技術(shù)在植物生物學(xué)中的應(yīng)用。

1 多重PCR技術(shù)的原理和發(fā)展

1.1 多重PCR技術(shù)的原理 多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，其原理與常規(guī)PCR基本相同，即它是在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入2對(duì)或2對(duì)以上的特異性引物，由于各引物都能與模板DNA特異性結(jié)合，因而可同時(shí)擴(kuò)增出針對(duì)多個(gè)DNA模板或同一模板不同區(qū)的多個(gè)目的DNA片段［8－10］，該方法可節(jié)省時(shí)間、降低成本、提高效率、加快試驗(yàn)進(jìn)程。該技術(shù)基于引物篩選的基礎(chǔ)上，需要對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行多次優(yōu)化。

1.2 多重PCR技術(shù)的發(fā)展 近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展和新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，基于傳統(tǒng)的多重PCR原理已開(kāi)發(fā)出一系列的新技術(shù)，如多重PCR生物芯片技術(shù)、雙寡聚核苷酸引物多重PCR技術(shù)、AFLP多重PCR、逆轉(zhuǎn)錄多重PCR、巢式多重PCR、實(shí)時(shí)多重PCR技術(shù)、熒光定量多重PCR等，以滿足實(shí)踐中不同研究和應(yīng)用的需求［11］。目前，基于多重PCR試劑盒的研發(fā)也取得了一些進(jìn)展，如QIAGEN公司研制出的一種新型多重PCR反應(yīng)緩沖系統(tǒng)，通過(guò)添加來(lái)調(diào)節(jié)平衡K+，以擴(kuò)大多重PCR反應(yīng)的最適退火溫度范圍;BioSource研制出的多重PCR試劑盒，可以直接用于目標(biāo)基因的檢測(cè)和分析［12］。

2 多重PCR技術(shù)在植物生物學(xué)研究中的應(yīng)用

2.1 植物種質(zhì)純度和屬性鑒定 多重PCR技術(shù)已成為植物種質(zhì)純度鑒定、血統(tǒng)歸屬辨別方面的一種高效、快捷的手段。在大田作物種質(zhì)純度鑒定方面，Arlorio等［13］應(yīng)用多重PCR將硬粒小麥和普通小麥區(qū)分開(kāi)，且是基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的擴(kuò)增，所以在高溫下也能有效工作。萬(wàn)映秀等［14］建立了3個(gè)多重PCR體系并應(yīng)用到141份國(guó)內(nèi)外小麥品種的檢測(cè)中，其結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果相比較，這3個(gè)多重PCR體系能夠準(zhǔn)確高效地檢測(cè)9個(gè)小麥品質(zhì)性狀的基因組成。譚君等［15］以3個(gè)玉米自交系、4個(gè)玉米雜交種為試驗(yàn)材料，建立了7對(duì)SSR引物的多重PCR體系，對(duì)玉米雜交種和自交種進(jìn)行鑒定，結(jié)果在準(zhǔn)確可靠性上優(yōu)于單一引物PCR，充分顯示出多重PCR高效快捷、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。陳浩東等［16］利用雙重PCR檢測(cè)體系對(duì)雜交棉種子純度進(jìn)行了鑒定，對(duì)親緣關(guān)系較近的品種間混雜進(jìn)行了三重、四重PCR擴(kuò)增，也得到了正常的擴(kuò)增結(jié)果，為進(jìn)一步簡(jiǎn)化棉花SSR多重PCR程序及優(yōu)化處理提供了有益參考。在園藝植物種質(zhì)鑒別方面，Polashock等［17］利用多重PCR技術(shù)快速地鑒別出不同基因型的美洲漿果;Li等［18］基于多重PCR分子檢測(cè)，鑒別出釀造葡萄酒和蘋(píng)果汁所用的果品種類。在植物血統(tǒng)歸屬方面，可以根據(jù)植物不同種質(zhì)的生物學(xué)特性，利用多重PCR進(jìn)行鑒別，如Pastorino等［19］采用多重PCR技術(shù)對(duì)不同種屬大豆的根瘤菌進(jìn)行擴(kuò)增，基于擴(kuò)增出不同大小的基因片段長(zhǎng)度將其血統(tǒng)歸屬辨別開(kāi)來(lái)，結(jié)果擴(kuò)增出的730 bp基因片段與我國(guó)血統(tǒng)的大豆根瘤菌的寄主品種特異基因同源，900 bp的基因片段與日本大豆根瘤菌的寄主品種的特異基因同源，故此較好地辨別出中國(guó)大豆和日本大豆。

2.2 轉(zhuǎn)基因植物鑒定 目前，多重PCR技術(shù)已成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物的鑒別實(shí)踐中［20］。2002年，Permingeat等［21］基于2對(duì)引物的PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)CryIA基因和PAT基因，成功地將轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米區(qū)分開(kāi)來(lái)。2005年，邵碧英等［22］提取玉米及其制品的總DNA，用PCR方法檢測(cè)其中的轉(zhuǎn)基因成分并篩選陽(yáng)性樣品，建立幾組玉米內(nèi)源zein基因和轉(zhuǎn)基因成分之間的多重PCR檢測(cè)方法，結(jié)果表明，所建立的多重PCR方法應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)玉米內(nèi)源基因和轉(zhuǎn)基因成分是可行的。2006年，邵碧英等［23］建立的馬鈴薯內(nèi)源PATA基因和3種轉(zhuǎn)基因成分之間的多重PCR檢測(cè)體系，能夠特異地應(yīng)用于馬鈴薯及其制品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)。2009年，王渭霞等［24］利用四重PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出目前為止轉(zhuǎn)基因水稻中常用的 CaMV35S、NOS、Bt、CpTi等外源基因。2011年，陳貞等［25］建立棉花轉(zhuǎn)基因成分六重PCR檢測(cè)體系，以棉花內(nèi)源基因sad1、報(bào)告基因GUS、外源抗蟲(chóng)基因Cry1Ab/Ac、篩選基因NPTⅡ、NOS終止子和CaMV35S啟動(dòng)子為檢測(cè)目標(biāo)，結(jié)果表明該多重PCR檢測(cè)體系能夠有效地從少至1顆棉籽的少量樣品中檢測(cè)出其中的轉(zhuǎn)基因成分。2013年，邱良焱等［26］以轉(zhuǎn)Bar、Bt基因的雙抗稻米為試驗(yàn)原料，針對(duì)其水稻內(nèi)源基因SPS和外源基因設(shè)計(jì)多重PCR檢測(cè)體系，成功地應(yīng)用該檢測(cè)體系快速地檢測(cè)出原料中的全部6條目標(biāo)基因。

2.3 植物病害檢測(cè) 多重PCR在生物體疾病診斷或檢測(cè)上的應(yīng)用是從人類開(kāi)始的，所以在人類和動(dòng)物上有著非常廣泛的應(yīng)用，并取得了巨大的成就。相比之下，多重PCR在植物病蟲(chóng)害檢測(cè)上的應(yīng)用研究較少。2001年，F(xiàn)raaije等［27］利用多重PCR一次性辨別出小麥的葉斑病、條銹病、黃銹病和褐銹病這4種病原體，然后提取出來(lái)并按量接種到19個(gè)小麥品種上，結(jié)果表明，大多數(shù)冬小麥品種的表現(xiàn)性狀與其接種量成正比，這為其他大樣本病害的早期檢測(cè)和防治提供了有益的參考。2002年，Dovas等［28］對(duì)感染黃化病的馬鈴薯植株進(jìn)行取樣分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯同時(shí)被2種病毒(TICV和ToCV)侵染，由于這2種病毒擴(kuò)增出的片段分別是229和466 bp，所以他們運(yùn)用多重PCR對(duì)樣品進(jìn)行分析，能快速、準(zhǔn)確地將其鑒別出來(lái)。2008年，岳紅妮等［29］通過(guò)多次優(yōu)化建立起可同時(shí)檢測(cè)大麥條紋花葉病毒、大麥黃矮病毒PAV株系、小麥黃花葉病毒和小麥藍(lán)矮植原體的多重PCR檢測(cè)體系，被這4種病毒復(fù)合侵染的小麥多重PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)了503、600、898和1 240 bp的4條特異性帶，實(shí)現(xiàn)了植原體DNA病原和病毒RNA病原的同時(shí)檢測(cè)，體現(xiàn)出多重PCR的優(yōu)越性。張顯勇等［30］也建立了可以同時(shí)檢測(cè)甘蔗花葉病和宿根矮化病的多重PCR檢測(cè)體系，能夠穩(wěn)定且特異地檢測(cè)出蔗株中是否有導(dǎo)致甘蔗花葉病和宿根矮化病的單一或混合的病原。2010年，譚小勇等［31］建立的三重PCR體系擴(kuò)增出615、480和945 bp的特異片段可同時(shí)用來(lái)檢測(cè)香蕉束頂病毒﹑黃瓜花葉病毒和香蕉線條病毒，進(jìn)一步利用該三重PCR技術(shù)初步檢測(cè)49份采自華南地區(qū)不同蕉區(qū)的田間樣品，結(jié)果表明該多重PCR體系可以有效地檢測(cè)上述3種病毒。2011年，趙芹等［32］根據(jù)小西葫蘆黃花葉病毒、番木瓜環(huán)斑病毒和黃瓜花葉病毒的外殼蛋白基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)了特異引物，在單一PCR的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)優(yōu)化，初步建立了能同時(shí)檢測(cè)以上3種病毒的多重PCR檢測(cè)體系，為節(jié)瓜病毒病原的檢測(cè)提供了理論與技術(shù)支持。

2.4 植物的抗病基因檢測(cè) 近年來(lái)，利用多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)2種以上抗病基因的研究越來(lái)越受到人們的重視。2005年，李君明等［33］利用多重PCR反應(yīng)體系，分別對(duì)番茄抗根結(jié)線蟲(chóng)的Mi基因、抗番茄花葉病毒病的Tm－22基因緊密連鎖的SCAR標(biāo)記進(jìn)行了同時(shí)擴(kuò)增篩選，擴(kuò)增的特異性片段與單引物擴(kuò)增片段基本完全吻合，再進(jìn)行酶切以鑒別雜純合基因型和感病基因型，該體系可用于在同一PCR反應(yīng)體系中，對(duì)2個(gè)抗病基因進(jìn)行同時(shí)篩選鑒定及苗期早期輔助選育。2008年，倪大虎等［34］利用多重PCR技術(shù)，可以在同一PCR反應(yīng)體系中同時(shí)選擇Pi9(t)基因和Xa21基因，與分別的單一PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致，提高了PCR的選擇效率。2011年，研究者［35］建立了可同時(shí)檢測(cè)抗馬鈴薯胞囊線蟲(chóng)H1基因，抗馬鈴薯X病毒RX1基因，抗馬鈴薯晚疫病R1、R2基因和抗馬鈴薯Y病毒Rychc基因的多重PCR檢測(cè)體系，并利用此體系檢測(cè)含有這5種抗病基因的96株雜交植株時(shí)，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，且用時(shí)比單一PCR少得多。2012年，陳濤等［36］利用與抗白粉病基因Pm21和Pm13連鎖的特異標(biāo)記，隨機(jī)挑選出114株含有抗白粉病基因Pm21和Pm13的雜交F4代群體進(jìn)行單一PCR和多重PCR檢測(cè)，其中5株具有Pm21的特異標(biāo)記，4株具有Pm13的特異標(biāo)記，還有4個(gè)單株同時(shí)具有Pm21和Pm13的特異標(biāo)記，多重PCR與單一PCR檢測(cè)結(jié)果一致。這說(shuō)明該體系可以應(yīng)用于對(duì)Pm21和Pm13的多重PCR檢測(cè)，能夠更加快速地檢測(cè)出含有這2個(gè)抗病基因的累加體材料。2013年，劉超勤等［37］只利用一次多重PCR反應(yīng)同時(shí)對(duì)番茄抗黃化曲葉病毒病的Ty-1、Ty-2基因，抗根結(jié)線蟲(chóng)病Mi基因和抗葉霉病Cf-5基因緊密連鎖的CAPS標(biāo)記進(jìn)行了篩選，經(jīng)酶切后所獲得的特異性片段大小與前人試驗(yàn)所得大小基本相同，證明了四重PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2.5 在植物育種上的應(yīng)用 近年來(lái)，育種學(xué)家們也把多重PCR技術(shù)運(yùn)用到多種植物育種過(guò)程中。2003年，研究者［38］運(yùn)用多重PCR技術(shù)分析澳大利亞主要的50個(gè)小麥栽培種的高分子量麥谷蛋白亞基，結(jié)果顯示僅有2個(gè)品種的高分子量麥谷蛋白亞基與前人測(cè)定的不同，隨后也證實(shí)了是前人檢測(cè)有誤。該體系中所使用的3個(gè)引物對(duì)都處于小麥不同的染色體組，這能同時(shí)鑒定出所有的高分子量麥谷蛋白亞基。2003年，張樹(shù)珍等［39］以PchsA為啟動(dòng)子構(gòu)建了康乃馨ACC氧化酶基因的反義植物表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把這個(gè)載體導(dǎo)入康乃馨優(yōu)良的栽培品種中，獲得3株轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)多重PCR和PCR-Southern雜交檢測(cè)，證實(shí)康乃馨ACC氧化酶的反義基因已經(jīng)整合到康乃馨的基因組中，獲得了能延長(zhǎng)插瓶壽命的康乃馨新品種。2007年，張曉科等［40］利用現(xiàn)有小麥品質(zhì)性狀基因的分子標(biāo)記，建立了3個(gè)多重PCR體系，并用已知性狀的品種進(jìn)行了驗(yàn)證。其中，多重PCR體系Ⅰ可用于一般的小麥品質(zhì)分子育種，以提高選育材料的整體加工品質(zhì)水平;體系Ⅱ可用于強(qiáng)筋小麥品種的選育;體系Ⅲ可用于淀粉品質(zhì)或糯小麥的選育。由于每個(gè)體系中的引物之間不存在相互抑制和錯(cuò)配，因此品種檢測(cè)的結(jié)果可靠、重復(fù)性好、成本低。將這3個(gè)多重PCR檢測(cè)體系用于小麥品質(zhì)育種的親本評(píng)價(jià)和雜交后代優(yōu)質(zhì)基因的聚合，有助于提高優(yōu)質(zhì)專用小麥品種評(píng)價(jià)和選育的效率。2009年，鄭寒等［41］基于小麥Ax1/Ax2、Dx5和Bx7OE等優(yōu)質(zhì)亞基的特異性分子標(biāo)記構(gòu)建相應(yīng)的多重PCR體系，經(jīng)過(guò)品種和群體檢驗(yàn)，利用該體系鑒定這些亞基的結(jié)果穩(wěn)定可靠、成本低。進(jìn)一步利用該技術(shù)對(duì)89份西藏小麥育成和推廣品種(系)的優(yōu)質(zhì)亞基頻率進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，該區(qū)小麥沒(méi)有檢測(cè)到Bx7OE，同時(shí)攜帶2個(gè)優(yōu)質(zhì)亞基的材料頻率約為10%。這說(shuō)明，多重PCR可作為一種可靠性高、實(shí)用性強(qiáng)的標(biāo)記輔助選擇技術(shù)用于小麥品質(zhì)育種親本評(píng)價(jià)和雜交聚合優(yōu)質(zhì)亞基基因小麥新品種的選育。在其他植物分子育種實(shí)踐中，多重PCR技術(shù)體系的建立和應(yīng)用研究也相繼展開(kāi)。

3 多重PCR技術(shù)在植物生物學(xué)研究中的應(yīng)用前景

分子方法研究植物是近20年植物生物學(xué)研究的重要發(fā)展階段，而許多分子方法的推進(jìn)都是基于新的PCR技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。相對(duì)單一PCR而言，多重PCR具有極大的優(yōu)越性:一次PCR反應(yīng)中能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因型，因而高效、快捷、經(jīng)濟(jì);PCR反應(yīng)中高度特異敏感，因而保證了擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠;試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、程序化、耗時(shí)少，在一定程度上加速了試驗(yàn)進(jìn)程。這些優(yōu)點(diǎn)使得多重PCR在多個(gè)方面得到了飛速發(fā)展，已經(jīng)在人類學(xué)、動(dòng)物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)、食品學(xué)研究等方面得到了廣泛應(yīng)用［42］。

由于多重PCR是在同一體系中進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，故其在植物生物學(xué)研究的實(shí)踐中不可避免地存在一定的問(wèn)題和缺陷，如可能存在多對(duì)引物之間的相互抑制、引物與非靶序列的結(jié)合產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，等。因此，在多重PCR的應(yīng)用中，如何合理設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化最佳多重PCR體系及反應(yīng)條件以減少非特異性擴(kuò)增至關(guān)重要。這通常需要基于反應(yīng)中的主要成分和反應(yīng)條件進(jìn)行多次優(yōu)化后以確定一個(gè)成熟的反應(yīng)體系，再視不同模板和引物來(lái)適當(dāng)調(diào)整試驗(yàn)條件［43］。也有一些研究者直接應(yīng)用與成熟的單一PCR反應(yīng)完全相同的條件，在遵循引物組合的一般原則下進(jìn)行多重PCR試驗(yàn)，同樣取得了令人滿意的結(jié)果［44］。這樣可以避免為建立多重PCR反應(yīng)體系需要進(jìn)行的繁瑣優(yōu)化試驗(yàn)，也相應(yīng)拓展了多重PCR技術(shù)在實(shí)際中的應(yīng)用范疇。

隨著多重PCR技術(shù)的不斷發(fā)展應(yīng)用，其與其他技術(shù)的結(jié)合也越來(lái)越多。如將多重PCR與毛細(xì)管電泳技術(shù)結(jié)合，可以提高基因分裂效率和檢測(cè)的準(zhǔn)確度［45］;將多重PCR與四色熒光技術(shù)結(jié)合，可以提高檢測(cè)的靈敏度和縮短檢測(cè)時(shí)間［46］，等。今后，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，多重PCR技術(shù)及與其他技術(shù)的結(jié)合在植物生物學(xué)研究中越來(lái)越受到廣大植物學(xué)家們的青睞，尤其是在DNA遺傳分析和基因檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景和發(fā)展方向。

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