劉楊靜，胡志雄,2，余小波，齊玉堂，張維農(nóng),2

(1. 武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023； 2. 農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023)

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1-十一烯酰溶血磷脂的選擇性合成與表征

劉楊靜1，胡志雄1,2，余小波1，齊玉堂1，張維農(nóng)1,2

(1. 武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023； 2. 農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023)

摘要：旨在建立一種選擇性合成1-十一烯酰溶血磷脂的有效方法與途徑。二丁基氧化錫與甘油磷脂酰膽堿形成復(fù)合物，在異丙醇溶劑體系中與十一烯酰氯反應(yīng)，選擇性合成得到1-十一烯酰溶血磷脂。產(chǎn)物純化后經(jīng)高效液相色譜、紅外光譜、電噴霧電離質(zhì)譜等手段進(jìn)行表征。產(chǎn)物經(jīng)表征后確證為1-十一烯酰溶血磷脂，且反應(yīng)的選擇性可達(dá)90%以上。該方法成本低廉、操作簡(jiǎn)便、條件溫和、易純化且得率高，所得產(chǎn)物1-十一烯酰溶血磷脂的結(jié)構(gòu)中含有“點(diǎn)擊反應(yīng)”活性的端烯基，在生物、醫(yī)藥、高分子、材料等領(lǐng)域中具有重要應(yīng)用價(jià)值與潛力。

關(guān)鍵詞：1-十一烯酰溶血磷脂；合成；甘油磷脂酰膽堿；二丁基氧化錫

1引言

磷脂是構(gòu)成生物膜的主要物質(zhì)，也是生命的基礎(chǔ)物質(zhì)之一[1~3]。溶血磷脂是由磷脂分子中一個(gè)?；湵凰獬闪u基后得到的產(chǎn)物，分為1-脂肪酰-2-溶血磷脂和2-脂肪酰-1-溶血磷脂兩類。溶血磷脂具有與磷脂類似的化學(xué)性質(zhì)，例如良好的乳化性、增溶性等，可廣泛用于食品、化妝品、農(nóng)用化學(xué)品、醫(yī)藥等行業(yè)[4~5]。此外，作為生物膜中的第二信使，溶血磷脂具有多種生物活性[6~7]，在許多的生理過(guò)程如血管形成[8]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)[9]、繁殖過(guò)程[10]等均起著十分重要的作用。然而，溶血磷脂在生物膜中的含量極低，從生物膜中分離提取溶血磷脂非常困難，目前主要采用生物酶解法或化學(xué)法合成。酶法合成具有定位性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、化學(xué)試劑使用少、反應(yīng)副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)[11]，但磷脂酶水解過(guò)程影響因素較多[12~14]，反應(yīng)條件難以控制且酶制品成本較高，不適于規(guī)?；苽涓呒兌热苎字?。

化學(xué)合成法成本較低，且原料較易得到，因而具有一定優(yōu)勢(shì)，目前合成溶血磷脂的起始原料主要有D-甘露醇、環(huán)氧丙烷、甘油酸等，這些合成路線過(guò)程冗長(zhǎng)、步驟復(fù)雜，得率較低。最近，以甘油磷脂酰膽堿(GPC)為起始原料的反應(yīng)路線受到廣泛關(guān)注，該方法可合成出構(gòu)型與天然溶血磷脂一致的溶血磷脂，還可根據(jù)需要靈活調(diào)節(jié)脂肪酰鏈的長(zhǎng)度。但是，由于GPC在常見(jiàn)有機(jī)溶劑中溶解度較低，所以選擇合適的溶劑與催化劑體系對(duì)于合成溶血磷脂非常關(guān)鍵。Chada等[15]以GPC為原料、氯化鎘為催化劑，在DMF或其他極性溶劑中合成得到1-脂肪酰-2-溶血磷脂，但該方法中所用的催化劑為重金屬元素化合物，排放到環(huán)境中不易降解而在食物鏈中富集[16]。

筆者以GPC為起始原料，在二丁基氧化錫/異丙醇催化反應(yīng)體系中對(duì)1-十一烯酰溶血磷脂的合成進(jìn)行了探索，并通過(guò)高效液相色譜、紅外光譜、電噴霧電離質(zhì)譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了表征。目標(biāo)產(chǎn)物1-十一烯酰溶血磷脂結(jié)構(gòu)中具有端烯基，可以發(fā)生巰基-烯類“點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)，有望在食品、醫(yī)藥、生物、高分子、材料等領(lǐng)域中拓展溶血磷脂的應(yīng)用價(jià)值與潛力，相關(guān)類型化合物的合成國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道，筆者將為相關(guān)溶血磷脂的合成提供可靠的途徑與方案。

2材料與方法

2.1　實(shí)驗(yàn)材料與試劑

甘油磷脂酰膽堿L-α-Glycerophosphorylcholine(純度99%)購(gòu)自湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司；二丁基氧化錫DBTO(純度99%)、十一烯酰氯(純度98%)均購(gòu)自上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；異丙醇、三乙胺、正庚烷、丙酮、乙酸均為分析純?cè)噭?；甲醇為美?guó)Merk公司色譜級(jí)試劑；正己烷、異丙醇均為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司色譜級(jí)試劑；實(shí)驗(yàn)所用水均為二次蒸餾水。

2.2　主要儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)，SK3300超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52CS、恒溫水浴鍋B-220、SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)，LC-20AT型號(hào)高效液相色譜儀(日本島津公司)配有Alltech ELSD 2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)GRACE公司)及WSK-A全自動(dòng)空氣發(fā)生器(天津津分分析儀器有限公司)，NEXUS670傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)尼高力儀器有限公司)，Thermo LTQ XL 高效液相串聯(lián)離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo公司)。

2.3　實(shí)驗(yàn)方法

2.3.11-十一烯酰溶血磷脂的合成

取1 g GPC(3.9 mmol)與1.065 g二丁基氧化錫DBTO(4.3 mmol)于100 mL單口圓底燒瓶中，加入40 mL異丙醇后攪拌均勻。裝上回流冷凝管，在85 ℃水浴下攪拌回流處理3 h，然后將混合溶液冷卻至25 ℃，逐滴加入三乙胺TEA(0.65 mL)與0.952 8 g十一烯酰氯(4.7 mmol)，加料完畢后繼續(xù)室溫下反應(yīng)1 h。

2.3.2產(chǎn)物的分離純化

反應(yīng)完成后，向反應(yīng)液中加入水/正庚烷(40/40，mL)兩相體系進(jìn)行萃取，棄去上層油相，醇水相繼續(xù)使用正庚烷(25 mL)萃取三次，然后真空旋蒸揮干溶劑，向殘留物中加入少量丙酮進(jìn)行溶解，然后置于2—8 ℃的冰箱中進(jìn)行重結(jié)晶，棄去上層丙酮清液，重結(jié)晶產(chǎn)物置于真空干燥箱中干燥即得產(chǎn)物。

2.3.3產(chǎn)物的高效液相色譜法(HPLC)分析

純化后的1-十一烯酰溶血磷脂與GPC經(jīng)甲醇溶解后，配制成濃度為1.7 mg/mL的甲醇溶液，在島津LC-20AT型高效液相色譜儀上進(jìn)行HPLC分析，檢測(cè)器為Alltech ELSD 2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)GRACE公司)并配備WSK-A全自動(dòng)空氣發(fā)生器(天津津分分析儀器有限公司)，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器內(nèi)漂移管溫度設(shè)定為80 ℃、空氣流速為2.2 L/min。色譜條件：Diol二醇基硅膠色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相A：正己烷/異丙醇/乙酸/三乙胺=84.4/14/1.5/0.08 (體積比)，流動(dòng)相B：異丙醇/水/乙酸/三乙胺=84.4/14/1.5/0.08 (體積比)，二元梯度洗脫模式下0—25 min內(nèi)由60%A+40%B梯度變化至100%B，然后使用100%B等度洗脫20 min，流動(dòng)相流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。

2.3.4產(chǎn)物的表征

產(chǎn)物經(jīng)分離純化及干燥處理后，使用紅外光譜、質(zhì)譜進(jìn)行表征。取適量樣品與KBr碾磨壓片，使用NEXUS670傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行透射掃描，掃描范圍為400—4 000 cm-1，掃描次數(shù)為16。產(chǎn)物的電噴霧質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS)分析采用直接進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，注射器流速為10 μL/min，噴霧電壓為4.5 kV，離子源類型為正離子源，掃描范圍為m/z50—600。

3結(jié)果與討論

3.1　反應(yīng)機(jī)理

以具有與天然溶血磷脂相同手性結(jié)構(gòu)的GPC為起始原料，將GPC經(jīng)DBTO活化后，在異丙醇中經(jīng)酰氯酯化制備溶血磷脂。由于GPC與DBTO配合物的反應(yīng)活性優(yōu)于異丙醇，并在離去時(shí)由于空間位阻效應(yīng)主要生成1位?；a(chǎn)物，從而具有較好選擇性。當(dāng)采用十一烯酰氯作為?；噭r(shí)，所得產(chǎn)物為1-十一烯酰溶血磷脂，其反應(yīng)機(jī)理如圖1所示。

圖1　1-十一烯酰溶血磷脂的反應(yīng)機(jī)理圖

3.2　1-十一烯酰溶血磷脂的合成與純化

二丁基氧化錫(DBTO)在鄰二醇衍生物的選擇性合成中有著廣泛應(yīng)用，如Michael等[17]將其用于鄰二醇的選擇性磺酰化合成中；Wagner等[18]將其用于糖衍生物的選擇性催化合成中。1-十一烯酰溶血磷脂的合成過(guò)程中，GPC與DBTO復(fù)合物的形成對(duì)于終產(chǎn)物的得率影響非常大，而GPC在常見(jiàn)的非極性溶劑中溶解性較差，所以相應(yīng)得率也會(huì)很低，如在特丁基甲醚、甲苯中按方法2.3.1反應(yīng)時(shí)，其轉(zhuǎn)化率只有3%—12%左右，而在甲醇、異丙醇中反應(yīng)，其轉(zhuǎn)化率可達(dá)42%和90%以上，甲醇作溶劑時(shí)的轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低的原因可能是在酯化反應(yīng)時(shí)會(huì)與GPC的烷基錫縮合物發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)作用。進(jìn)一步采用其它常見(jiàn)溶劑試驗(yàn)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化率的大小順序?yàn)椋郝确?乙腈<二氯甲烷<四氫呋喃<二甲亞砜，轉(zhuǎn)化率均小于25%，故本實(shí)驗(yàn)選擇異丙醇作為溶劑效果最佳。

常見(jiàn)用于酯化反應(yīng)的脂肪酸衍生物主要有羧酸、酰氯、酸酐、甲酯等，本實(shí)驗(yàn)以十一烯酸、十一烯酰氯為原料按方法2.3.1進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果表明十一烯酸無(wú)法得到目標(biāo)產(chǎn)物，即使采用4-二甲氨基吡啶(DMAP) 代替三乙胺作催化劑，同樣沒(méi)有改善。反應(yīng)混合物采用水/正庚烷兩相體系進(jìn)行萃取時(shí)，產(chǎn)物1-十一烯酰溶血磷脂由于極性較強(qiáng)，主要分配于醇水相中，DBTO及過(guò)量酰氯與異丙醇生成的十一烯酸異丙醇酯主要分配于正庚烷相中，經(jīng)多次萃取及丙酮重結(jié)晶后即可得到純度較高的1-十一烯酰溶血磷脂。

3.3　1-十一烯酰溶血磷脂的HPLC分析

GPC與溶血磷脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)中無(wú)生色團(tuán)，在紫外光區(qū)的吸收非常弱，盡管1-十一烯酰溶血磷脂分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)烯鍵，但采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)時(shí)靈敏度仍不理想，故本實(shí)驗(yàn)采用高靈敏的通用型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)優(yōu)化后液相色譜測(cè)定方法如方法2.3.3中所述。HPLC分析結(jié)果如譜圖2所示，由圖2可知，在二醇基硅膠色譜固定相保留作用下，GPC由于極性最強(qiáng)，保留時(shí)間最長(zhǎng)，為22.44 min；而sn-1、sn-2 十一烯酰溶血磷脂極性相對(duì)較弱，因而保留比GPC相對(duì)較弱，保留時(shí)間分別為14.26 min、9.35 min；目標(biāo)物色譜峰形對(duì)稱，與其它雜質(zhì)成分分離效果非常完美。根據(jù)峰面積進(jìn)行歸一化分析，所得產(chǎn)品純度很高，可達(dá)90%以上。

圖2　GPC與1-十一烯酰溶血磷脂樣品的高效液相色譜圖

3.4　1-十一烯酰溶血磷脂的紅外光譜表征

反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)方法2.3.2進(jìn)行分離純化并干燥后，與KBr碾磨壓片，使用NEXUS670傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行透射掃描，所得紅外掃描結(jié)果如圖3中實(shí)線所示。為了比較反應(yīng)前后基團(tuán)的變化情況，反應(yīng)原料GPC也在相同條件下進(jìn)行紅外掃描，結(jié)果如圖3中虛線所示。

圖3　1-十一烯酰溶血磷脂樣品(實(shí)線)與GPC(虛線)的紅外光譜圖

紅外光譜結(jié)果顯示：1-十一烯酰溶血磷脂產(chǎn)物與GPC在3 400 cm-1左右均有較強(qiáng)的吸收峰，該峰為—OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，相比較而言，1-十一烯酰溶血磷脂在3 405.47 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度遠(yuǎn)小于GPC在3 414.38 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度，這與GPC中1位的—OH經(jīng)十一烯酰氯酯化后使得羥基數(shù)減少的情況相一致。另外，1-十一烯酰溶血磷脂產(chǎn)物譜圖中2 973.85 cm-1、2 935.86 cm-1為飽和脂肪烴鏈中—CH2的C—H的伸縮振動(dòng)吸收峰，該吸收峰的強(qiáng)度比GPC譜圖中2 957.35 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說(shuō)明其分子結(jié)構(gòu)中碳鏈長(zhǎng)度較GPC明顯增長(zhǎng)，亦即十一烯酰氯已成功與—OH進(jìn)行反應(yīng)。1-十一烯酰溶血磷脂樣品譜圖中1 730.37 cm-1處的吸收峰為C=O基團(tuán)的振動(dòng)吸收峰，1 397.82 cm-1處的吸收峰為C=C—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)的吸收峰；而GPC譜圖中均未見(jiàn)對(duì)應(yīng)吸收峰。綜合以上分析可知，1-十一烯酰溶血磷脂已通過(guò)該方法成功合成。

3.5　1-十一烯酰溶血磷脂的質(zhì)譜定性分析

為了對(duì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步定性分析，純化后的樣品在HPLC分析時(shí)進(jìn)行分流收集，將收集到的目標(biāo)峰直接進(jìn)樣進(jìn)行ESI-MS分析，圖4為產(chǎn)物收集液的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果，其中一級(jí)質(zhì)譜圖4(A)中豐度最強(qiáng)的質(zhì)荷比424.11的質(zhì)譜峰為1-十一烯酰溶血磷脂的M+H準(zhǔn)分子離子峰；質(zhì)荷比258.03的質(zhì)譜峰為失去1位的十一烯?；笮纬傻乃槠x子峰；質(zhì)荷比183.93的質(zhì)譜峰為3位碳上連接的(CH3)3N(CH2)2PO4-基團(tuán)斷裂后形成的碎片離子峰。

圖4　1-十一烯酰溶血磷脂樣品ESI-MS一級(jí)(A)、二級(jí)(B)電噴霧電離質(zhì)譜圖

以質(zhì)荷比為424.11的離子作為母離子，得到二級(jí)質(zhì)譜圖如圖4(B)所示，其中豐度最強(qiáng)的質(zhì)荷比406.28處的質(zhì)譜峰為準(zhǔn)分子離子失去-OH以及結(jié)合H后形成的碎片離子峰，質(zhì)荷比184.00的質(zhì)譜峰為(CH3)3N(CH2)2PO4-基團(tuán)斷裂后形成的碎片離子峰，再次印證了關(guān)于目標(biāo)產(chǎn)物中存在(CH3)3N(CH2)2PO4-基團(tuán)的判斷。由以上ESI-MS一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜的結(jié)果分析可知，所合成的產(chǎn)物與1-十一烯酰溶血磷脂的質(zhì)譜特征相符。

4結(jié)束語(yǔ)

筆者以二丁基氧化錫與GPC在異丙醇溶劑體系中形成復(fù)合物，然后經(jīng)十一烯酰氯酯化，選擇性合成得到1-十一烯酰溶血磷脂，產(chǎn)物得率可達(dá)90%以上。該方法成本低廉、操作簡(jiǎn)便、條件溫和、易純化且得率高，純化后的產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜、紅外光譜、電噴霧電離質(zhì)譜等手段進(jìn)行表征、確證。所得產(chǎn)物1-十一烯酰溶血磷脂的結(jié)構(gòu)中含有“點(diǎn)擊反應(yīng)”活性的端烯基，在生物、醫(yī)藥、高分子、材料等領(lǐng)域中具有重要應(yīng)用價(jià)值與潛力。

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Selective synthesis and characterization of 1- undecenoyl -sn-glycero-3-phosphocholine

LIUYang-jing1,HUZhi-xiong1,2,YUXiao-bo1,QIYu-tang1,ZHANGWei-nong1,2

(1. School of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China;

2.Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products, Wuhan 430023, China)

Abstract：To establish a method for the selective synthesis of 1-undecenoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine. A practical selective synthesis of 1-undecenoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine has been established through the selective acylation of the complex of L-α-Glycerophosphorylcholine and dibutyltin oxide (DBTO) by undecenoate chloride. The purified product has been analyzed and identified by high performance liquid chromatography (HPLC), infrared spectrum (IR) and electrospray ionization mass spectrum (ESI-MS). The product has been proved to be 1-undecenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, and the selectivity of reaction up to 90%. The proposed method can provide many advantages such as low cost, simple operation, mild reaction conditions, high yield and easy product purification process. The product 1-undecenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine contains a “click chemistry” active alkenyl group which will guarantee its wide application value and potential in the field of biology, medicine, polymer and materials.

Key words：1-undecenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; synthesis; L-α-Glycerophosphoryl- choline; dibutyltin oxide

基金項(xiàng)目：湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(D20141705).

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2015.02.016 10.3969/j.issn.2095-7386.2015.02.014

文章編號(hào)：2095-7386(2015)02-0070-04 2095-7386(2015)02-0060-05

通信作者：石雄(1968-)，男，教授，E-mail:stonehero@163.net. 王麗梅(1980-)，女，副教授，博士，E-mail：wanglimeiyx@163.com.

作者簡(jiǎn)介：楊培凱(1989-)，男，碩士研究生，E-mail:278851511@qq.com. 朱才會(huì)(1991-)，男，本科生，E-mail：1044582163@qq.com.

收稿日期：2014-12-05. 2015-02-03.

中圖分類號(hào)：TQ 460.31

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A