張紹陽，姚 永，羅 靜，徐昌杰(．銅仁學(xué)院生物與農(nóng)林工程學(xué)院梵凈山特色動植物資源重點實驗室，貴州銅仁554300;2．浙江大學(xué)果實品質(zhì)生物學(xué)實驗室/浙江省園藝植物整合生物學(xué)研究與應(yīng)用重點實驗室，浙江杭州30058)

簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，又稱為微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)，是在生物基因組中由1～6個核苷酸組成的基本序列單元(或基序)多次重復(fù)串聯(lián)構(gòu)成的DNA序列，序列長度一般不超過200 bp［1］。SSR標(biāo)記技術(shù)可用于果樹種質(zhì)資源遺傳多樣性、進(jìn)化與分類、品種鑒定、同物異名和同名異物品種的鑒別、無性系和體細(xì)胞突變的鑒別、DNA指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源保存和利用以及分子遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等研究，是目前果樹遺傳育種研究廣泛應(yīng)用的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)［2-4］。

楊梅(2n=16)，又名朱紅、樹莓或龍晴，亞熱帶常綠喬木或灌木雌雄異株果樹，為楊梅科(Myricaceae)楊梅屬(Myrica L．)植物［5］;在我國，本屬植物有 6 種和 5 個變種(變型)，栽培楊梅品種有305個，品系為120個，均屬于楊梅(M．rubra)種［6-7］。楊梅是我國南方地區(qū)特色水果［7］，其果實于5月底～7月初成熟，成熟果實色澤鮮艷，柔嫩多汁，風(fēng)味獨特，果實含鉀量高，具有較高的營養(yǎng)和醫(yī)療保健價值［8-10］。楊梅具有較高的栽培經(jīng)濟價值，現(xiàn)為浙江省第二大果樹經(jīng)濟作物(僅次于柑橘)。

自2006年日本學(xué)者Terakawa等［11］報道楊梅SSR標(biāo)記研究以來，近年來陸續(xù)有楊梅SSR標(biāo)記相關(guān)研究的報道，這些研究很好地推進(jìn)了楊梅種質(zhì)資源研究工作?；诖?，筆者先對SSR標(biāo)記主要技術(shù)特性進(jìn)行概述，再對SSR標(biāo)記技術(shù)在楊梅上的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 SSR標(biāo)記技術(shù)概述

1．1 SSR位點的類型及其特征 SSR位點廣泛分布于植物基因組的不同位置，SSR位點不僅數(shù)量眾多，而且也存在各種類型。在植物全基因組上，SSR位點數(shù)量可達(dá)104～105，廣泛存在于基因組的各個區(qū)域，每隔10～50 kb就有1個SSR位點存在，SSR重復(fù)單位的堿基組成和重復(fù)次數(shù)因物種而異［2-3］。

依據(jù)重復(fù)單元(或基序)堿基個數(shù)不同，SSR可分為單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸等重復(fù)類型。對于上述幾種類型的SSR在全基因組上的構(gòu)成，不同植物其構(gòu)成也不盡相同。據(jù)報道，單核苷酸SSR在所有植物全基因組上數(shù)量最多(而且都是以A/T重復(fù)SSR為主)，五和六堿基核苷酸SSR明顯少于其他類型的SSR;各種類型的SSR頻率(即在全基因組上總體數(shù)量)隨著重復(fù)次數(shù)增加而逐漸降低［12-14］。在葡萄和蘋果上，二核苷酸SSR數(shù)量僅次于單核苷酸SSR，且AT/TA重復(fù)的SSR占該類型SSR總量的30%以上，三核苷酸SSR同單核苷酸SSR與二核苷酸SSR一起構(gòu)成該類型植物基因組SSR的主體［12-13］;在擬南芥、水稻、大豆、玉米、高粱、苜蓿和楊樹等植物上，單核苷酸至四核苷酸4種重復(fù)類型SSR占此幾種植物全基因組SSR的絕大多數(shù)，其他類型SSR僅為總SSR的10%左右［14］。在葡萄上，SSR主要分布在基因間隔區(qū)，其次在基因的非翻譯區(qū)，基因編碼區(qū)SSR密度最小;三核苷酸SSR和六核苷酸SSR比其他SSR在編碼區(qū)豐度要高，分別為19個/Mb和10個/Mb;數(shù)量豐富且易突變的二核苷酸SSR是開發(fā)SSR標(biāo)記的重要來源［12］。

依據(jù)重復(fù)序列長度，Temnykh等［15］將SSR分為兩類，第一類為ClassⅠSSR(高度可變類型)，其重復(fù)序列長度不低于20 bp;第二類為ClassⅡSSR(潛在可變類型)，其重復(fù)序列長度處于10～20 bp。依據(jù)核心序列排列方式不同，SSR可分為完全型、不完全型和復(fù)合型3種類型。完全型SSR的核心序列以不間斷的重復(fù)方式首尾相連，目前研究的SSR大多屬于此類;不完全型SSR的核心序列在非末端有不多于3個非重復(fù)堿基;復(fù)合型SSR，是指由2個或2個以上的核心序列串聯(lián)組成的DNA片段，基本單元序列相同的2個核心序列之間要有不少于3個的非重復(fù)堿基［16］。后2種類型SSR在植物基因組中也占有一定比例，但目前此2種SSR標(biāo)記研究很少。依據(jù)所在位點序列的來源，SSR也有3種類型:來源于各種基因組DNA序列的普通SSR(即genomic SSR)，來自于各基因編碼區(qū)序列的EST-SSR(又可稱為cDNA-SSR，cSSR或genic SSR)，以及來源自于細(xì)胞核外DNA序列的核外SSR(如葉綠體SSR和線粒體SSR等)。

1．2 SSR的遺傳特性 起初，SSR序列被認(rèn)為是一類垃圾DNA序列，不轉(zhuǎn)錄也不發(fā)揮生理調(diào)控功能。后來發(fā)現(xiàn)SSR在基因組上并不是隨機分布的，一般基因間隔區(qū)DNA序列中SSR豐度比轉(zhuǎn)錄區(qū)高;在轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、5'UTR(Untranslated regions，非翻譯區(qū))區(qū)、編碼區(qū)和3'UTR區(qū)，SSR豐度呈依次下降趨勢;SSR序列也有其特定的生物功能，如編碼區(qū)SSR可導(dǎo)致蛋白質(zhì)種類和功能改變，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)SSR能影響基因轉(zhuǎn)錄效率，位于UTR的SSR位點長度可影響下游基因的翻譯效率等［17-19］。不同生物種類SSR構(gòu)成具有一定的特異性，SSR序列(包括基序種類和重復(fù)數(shù)大小)隨著基因組位點不同而異，同一位點不同基因型生物個體SSR重復(fù)序列大小也可能有很大差異，SSR序列這種高度變異性就是SSR序列相關(guān)DNA標(biāo)記技術(shù)產(chǎn)生DNA片段長度多態(tài)性的分子基礎(chǔ)［20］。一般認(rèn)為，單個SSR位點在不同基因型個體之間的多態(tài)性主要是由于DNA復(fù)制和修復(fù)過程中堿基滑動、錯配或減數(shù)分裂過程中姐妹染色單體的不均等交換而造成［19，21-22］。

1．3 SSR標(biāo)記技術(shù)原理及特點 SSR最初只是作為探針，用于真核生物基因組的RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制片段長度多態(tài)性)研究。隨著PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)建立，SSR廣泛應(yīng)用于DNA標(biāo)記研究?；赟SR序列的多態(tài)性，即同一SSR位點在同種生物不同基因型的重復(fù)單元數(shù)有很大變化，產(chǎn)生了數(shù)種DNA標(biāo)記技術(shù)，如SSR標(biāo)記、ISSR(Inter-Simple Repeat Sequence，簡單重復(fù)序列區(qū)間)標(biāo)記［23］、RAMP(Random Amplified Microsatellite Polymorphisms，隨機擴增微衛(wèi)星多態(tài)性)標(biāo)記［24］和 REMAP(Retrotransposon Microsatellite Amplified Polymorphisms，逆轉(zhuǎn)座子微衛(wèi)星擴增多態(tài)性)標(biāo)記［25］。

SSR標(biāo)記技術(shù)是利用SSR序列比較保守的兩翼序列設(shè)計成對引物組合進(jìn)行PCR擴增，不同基因型樣品的同一位點SSR-PCR產(chǎn)物則有可能會在凝膠(現(xiàn)多為聚丙烯酰胺凝膠)電泳上呈現(xiàn)長度的差異［26］。因SSR-PCR產(chǎn)物在凝膠電泳上呈現(xiàn)DNA片段長度的多態(tài)性，SSR標(biāo)記又被稱為SSLP(Simple Sequence Length Polymorphisms，簡單序列重復(fù)長度多態(tài)性)標(biāo)記。SSR標(biāo)記具有數(shù)量多、分布廣泛、呈共顯性遺傳和遺傳信息豐富等特點。同時，SSR標(biāo)記技術(shù)具有位點特異性、共顯性、對DNA需要量少、對DNA質(zhì)量要求不高、易于PCR檢測、重復(fù)性好、操作簡便以及適合高通量分析等特點［27］。PCR標(biāo)記技術(shù)的重復(fù)性非常好，對于同一批SSR標(biāo)記分析，不同工作人員其試驗結(jié)果有很好的一致性［28］。

1．4 SSR標(biāo)記開發(fā) 由于SSR標(biāo)記是特異引物標(biāo)記，必須先獲取相關(guān)DNA序列，以找出相應(yīng)SSR位點并依據(jù)其兩翼序列設(shè)計成對PCR引物，才能進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，所以SSR標(biāo)記技術(shù)存在引物開發(fā)的問題［29］。以往獲得SSR位點兩側(cè)序列或相應(yīng)特異引物，通常采用以下途徑:第一，利用SSR引物在近緣物種的通用性以及SSR引物具有很好的重復(fù)性能夠在不同實驗室共享等特性，搜集相關(guān)研究(主要包括有關(guān)文獻(xiàn))中所用的SSR引物;第二，查詢相關(guān)生物信息公共數(shù)據(jù)庫(如NCBI和EMBL等)，下載研究物種相關(guān)DNA序列，對其進(jìn)行去冗余、去低質(zhì)量序列和序列拼接處理，再采用軟件(如Primer Premier 5．0或BatchPrimer 3等)設(shè)計引物;第三，構(gòu)建相關(guān)DNA或cDNA文庫，篩選SSR位點，然后根據(jù)兩翼序列設(shè)計引物［30］。

除一些模式植物或主要作物外，通過前2條途徑獲得的植物SSR引物數(shù)量通常極其有限，難以滿足遺傳育種應(yīng)用研究的需要，為此需要采用第3條途徑開發(fā)SSR標(biāo)記。關(guān)于采用此途徑挖掘SSR位點或開發(fā)相應(yīng)引物，目前報道有很多種策略［29，31-32］。然而，這些策略，其試驗過程都非常復(fù)雜，而且還需要大量的測序，因此，通過此途徑開發(fā)SSR引物費時費力，需要很高的試驗費用。而且，即便采用此方法挖掘SSR位點，所獲得SSR位點的數(shù)量也非常有限，使得SSR標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的更廣泛應(yīng)用受到了瓶頸性制約影響。

植物的一個全基因組或轉(zhuǎn)錄組上SSR位點十分豐富，其數(shù)量可達(dá)數(shù)萬甚至幾十萬個［33］，這些SSR位點都是植物SSR標(biāo)記應(yīng)用研究所需要的寶貴資源。以前限于Sanger測序能力有限，從中開發(fā)出的SSR標(biāo)記數(shù)量微乎其微。隨著近些年來新一代測序(Next-Generation Sequencing，NGS)技術(shù)與生物信息學(xué)工具異軍突起，通過全基因組測序或轉(zhuǎn)錄組測序便可以將一個植物的整個基因組或轉(zhuǎn)錄組上絕大部分SSR位點挖掘出來，這為絕大多數(shù)植物SSR標(biāo)記大量開發(fā)提供了一種重要捷徑［34-35］。

盡管植物基因組蘊含的SSR位點數(shù)量比轉(zhuǎn)錄組含有的SSR位點數(shù)量高出幾倍甚至數(shù)十倍［33］，但基于轉(zhuǎn)錄組測序平臺開發(fā)SSR標(biāo)記的相關(guān)研究仍發(fā)展較快。究其原因，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已逐步取代基因芯片技術(shù)成為目前在全基因組水平上研究基因表達(dá)的主流方法。通過該技術(shù)，可以獲得某一生物樣品的低表達(dá)基因、不同樣品間的表達(dá)差異、轉(zhuǎn)錄發(fā)生位點、轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐度以及SNP等重要結(jié)果［35-36］。進(jìn)行SSR標(biāo)記開發(fā)研究，也已逐漸成為植物轉(zhuǎn)錄組測序分析的一項重要內(nèi)容。而且，從轉(zhuǎn)錄組測序獲得的SSR都是ESTSSR，其序列都是轉(zhuǎn)錄本，因而這些SSR可能會與某些功能基因相關(guān)，開發(fā)出來的SSR標(biāo)記有可能成為與某些生物表型性狀相關(guān)的分子標(biāo)記［37］。另外，雖然轉(zhuǎn)錄組EST-SSR多態(tài)性比基因組SSR低，但在近緣關(guān)系的植物之間可能有更好的通用性［38］。近年來，已有很多植物(包括楊梅)通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)開發(fā)了大量的 SSR標(biāo)記［34，38-48］，與基于新一代測序技術(shù)開展的全基因組 SSR標(biāo)記研究，如在楊梅［49-50］、可可［51］、玉米［52］、芝麻［53］、棗［54］、白菜［55］等植物上，相得益彰。

2 楊梅SSR標(biāo)記研究概況

2．1 國外研究概況 楊梅是我國特色栽培果樹，其在國外分布很少，關(guān)于楊梅SSR標(biāo)記研究也僅有2篇報道。2006年，Terakawa等［11］從富集CT重復(fù)序列的楊梅基因組文庫克隆文庫中開發(fā)出了13個SSR標(biāo)記，并對32個楊梅樣品進(jìn)行了標(biāo)記鑒別和遺傳多樣性分析。2009年，Terabawa等［56］又利用其中10個SSR標(biāo)記，分析所研究區(qū)域福島獼猴糞便所含楊梅種子的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)福島獼猴散播種子在楊梅種群遺傳多樣性的形成和維持中起著重要作用。

2．2 國內(nèi)研究概況 國內(nèi)學(xué)者對楊梅SSR標(biāo)記研究已有8篇(有7篇為外文)，除其中1篇(Xie等［57］)作者所在單位為浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所外，其他7篇均由浙江大學(xué)果樹科學(xué)研究所的研究者發(fā)表。

2009年，Zhang等［58］從‘荸薺’楊梅不同組織 EST文庫克隆片段序列和克隆的MYB相關(guān)基因cDNA序列中分別獲得了9個和2個SSR位點，并用保存在浙江省余姚市的中國楊梅資源圃［7］中的32個楊梅品種分析了各個SSR位點的多態(tài)性特征。2011年，Xie等［59］利用已研究的14個 SSR標(biāo)記［11，58］，采用熒光SSR標(biāo)記技術(shù)，對保存在上述楊梅資源圃內(nèi)的122個楊梅樣品(主要來源于我國7個省)和1個蠟楊梅(M．cerifera)樣品進(jìn)行了遺傳聚類分析，將其分為幾個類別，并發(fā)現(xiàn)同一地理區(qū)域的樣品遺傳差異相對較小;又用其中的10個SSR標(biāo)記構(gòu)建了52個主要樣品的DNA指紋圖譜;發(fā)現(xiàn)楊梅的SSR引物可以通用于蠟楊梅相關(guān)研究。Xie等［57］以G(G/C)G(GT)6作為富集SSR序列的引物，利用ISSR抑制PCR法，從‘黑晶’楊梅基因組DNA中獲得了完全型和復(fù)合型SSR位點各6對引物，并用24個楊梅和2個矮楊梅(M．nana)作為樣品進(jìn)行篩選，從中開發(fā)出了9個SSR標(biāo)記，該研究為楊梅或其他一些植物SSR標(biāo)記開發(fā)提供了一種策略或思路。

2012 年，Jiao等［49］采用Illumina Hi-Seq 2000 測序平臺對用楊梅株系‘C1020-55’所構(gòu)建250和500 bp的基因組文庫進(jìn)行高通測序，產(chǎn)生了9．01 Gb序列數(shù)據(jù)(楊梅基因組323 Mb的26倍覆蓋度)，應(yīng)用 MISA(http://pgrc．ipk-gatersleben．de/misa/misa．html)從初步拼接的各 scaffold序列片段(總大小為255 Mb)中鑒別出28，602個SSR位點(不含單核苷酸和非完全型SSR位點)，發(fā)現(xiàn)二核苷酸SSR數(shù)量最大(占總量的 84．73%)，用 BatchPrimer3 軟件(http://pgrc．ipk-gatersleben．de/misa)設(shè)計引物，從中選取600對引物，并用29個楊梅和3個楊梅屬其他植物樣品進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選出158個SSR標(biāo)記(每個SSR位點平均可產(chǎn)生8．25個等位條帶，多態(tài)性信息含量平均為0．67)，并對所獲得SSR標(biāo)記在楊梅屬植物間的通用性進(jìn)行了分析?；贔eng等［60］的‘荸薺’楊梅Illumina Hi-Seq 2000轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，通過重頭拼接所獲得41 239條 Unigenes序列(總大小為20．9 Mb，平均大小為539 bp)，Zhang等［43］利用MISA軟件鑒別ESTSSR位點，發(fā)現(xiàn)6883個EST-SSR位點位于5 472條Unigenes上(出現(xiàn)頻率為每3．2 Kb含1個 EST-SSR位點)，每個位點序列長度為10～48 bp，二核苷酸和三核苷酸EST-SSR位點所占比例超過總量的75%，有1326個EST-SSR位點包含在594個復(fù)合EST-SSR序列中，其他5557個位點則為完全型ESR-SSR;從6 151個EST-SSR中，選取412個用于設(shè)計SSR引物，成功設(shè)計267對引物，并用10個楊梅主要品種(系)，篩選出109個EST-SSR標(biāo)記(產(chǎn)生了389個等位片段，多態(tài)性比率為 93．8%)。

2014 年，Jia等［50］基于 Jiao等［49］高通測序結(jié)果又開發(fā)出了107個SSR標(biāo)記。至此，楊梅研究可用的SSR標(biāo)記(包括EST-SSR標(biāo)記)由2012年前的36個上升至410個，為楊梅種質(zhì)資源SSR標(biāo)記研究奠定了良好基礎(chǔ)。在上述研究中，Jia等［50］用所獲得全部SSR標(biāo)記對45個楊梅樣品進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，確認(rèn)了研究小組前期研究結(jié)論，使得各主要楊梅品種(品系)遺傳關(guān)系更為明確;優(yōu)系‘Y2010-70’、‘Y2012-140’及‘Y2012-145’也被從基因型上確定為新品系。汪國云等［61］基于 Xie等［57］構(gòu)建的楊梅品種鑒別指紋圖譜結(jié)果，選用相同的引物，對9個楊梅品種，基于遺傳測序儀高效和自動化特性，構(gòu)建了多重?zé)晒釹SR標(biāo)記鑒別DNA指紋圖譜，為相應(yīng)果實質(zhì)量檢測及優(yōu)良品系選擇提供了很大便利。

2015 年，基于前期研究［43］，Zhang 等［62］對楊梅 11 個類型EST-SSR的多態(tài)性(包括多態(tài)性比率和單個位點多態(tài)性水平)比較研究，發(fā)現(xiàn)不同類型EST-SSR多態(tài)性差異十分顯著，研究結(jié)果對于楊梅和其他果樹轉(zhuǎn)錄組(或基因組)多態(tài)性SSR標(biāo)記的高效率篩選具有較好的參考作用。

3 總結(jié)與展望

SSR標(biāo)記技術(shù)具有其他DNA標(biāo)記技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢，新一代測序技術(shù)能夠大大推動許多植物SSR標(biāo)記的大量開發(fā)，SSR標(biāo)記技術(shù)也將得到更為廣泛的應(yīng)用。作為我國特色的果樹種質(zhì)資源，近年來，國內(nèi)對楊梅SSR標(biāo)記研究已取得長足進(jìn)展，開發(fā)了眾多的SSR標(biāo)記，并在一定程度明確了許多重要楊梅品系的親緣關(guān)系，為后續(xù)更多的楊梅種質(zhì)資源SSR標(biāo)記研究奠定了良好基礎(chǔ)。

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