劉 勇， 王良群， 楊 偉， 郝艷芳， 張 微， 白鴻雁， 張曉娟， 武 擘

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所,山西晉中 030600)

?

組織培養(yǎng)在高粱中的應(yīng)用研究進(jìn)展

劉 勇， 王良群， 楊 偉， 郝艷芳， 張 微， 白鴻雁， 張曉娟， 武 擘

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所,山西晉中 030600)

主要從胚培養(yǎng)、幼葉培養(yǎng)、莖尖培養(yǎng)、幼穗培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、幼苗培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)等方面介紹了高粱組織培養(yǎng)方面的研究進(jìn)展,最后對高粱組織培養(yǎng)的發(fā)展進(jìn)行了展望。

組織培養(yǎng)；高粱；應(yīng)用

高粱(Sorghumbicolor(L.)Moench)屬于禾本科(Graminea)高粱族(Andropogoneae)高粱屬(Sorghum)，是全球重要的旱糧作物之一，在非洲、亞洲、大洋洲和美洲的105個(gè)國家和地區(qū)均有種植，每年大約種植4.2×107hm2，其主產(chǎn)國有美國、尼日利亞、印度、墨西哥、蘇丹、中國、澳大利亞和阿根廷[1]。我國是高粱種植大國，年生產(chǎn)能力在500萬t左右，主要集中在遼寧、吉林、黑龍江、山西和內(nèi)蒙古等省。其中，遼寧省23.3萬hm2，吉林、黑龍江和山西各13.3萬hm2，內(nèi)蒙古10.0萬hm2。

高粱在糧食、飼料、糖料和能源以及秸稈利用等方面，有多種值得開發(fā)的加工領(lǐng)域[2]。在全球糧食、能源日益短缺的情況下，發(fā)展高粱生產(chǎn)，必將有助于緩解這些危機(jī)[3]。但高粱育種研究面臨品種遺傳變異性小、遺傳力低、品種改良耗時(shí)長等問題。組織培養(yǎng)是指在無菌條件下利用人工培養(yǎng)基對外植體進(jìn)行培養(yǎng)，是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和植物改良研究的基本環(huán)節(jié)。對高粱組織進(jìn)行培養(yǎng)及再生，其目的在于讓外植體能夠高頻率地誘導(dǎo)出愈傷組織，建立高效的體細(xì)胞再生體系，為高粱遺傳轉(zhuǎn)化和細(xì)胞工程研究創(chuàng)造有利條件[4]。韓福光等[5]報(bào)道，最早進(jìn)行高粱組織培養(yǎng)研究的是Strogonol，1965年，他利用高粱根和分孽節(jié)在MS培養(yǎng)基上添加1 mg/L 2,4-D、1 mg/L的KT、5 mg/L泛酸鈣和1 mg/L抗壞血酸誘導(dǎo)出愈傷組織，未能獲得再生植株。之后Maseltler等[6]以芽原基為外植體，在附加1～5 mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織，并獲得了再生植株。此后，高粱組織培養(yǎng)工作不斷進(jìn)行。筆者根據(jù)自己的工作實(shí)踐，分別從高粱組織培養(yǎng)胚培養(yǎng)、幼葉培養(yǎng)、莖尖培養(yǎng)、幼穗培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、幼苗培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)等方面對組織培養(yǎng)在高粱中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為我國高粱育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 胚培養(yǎng)

1.1 未成熟胚的培養(yǎng)高粱外植體的培養(yǎng)是組織培養(yǎng)中重要的一步，目前多以未成熟胚為主要材料。國外學(xué)者如Gamborg等[7]、Dunsant等[8-9]、Brettel等[10]、Ma等[11]、Lusardi等[12]、Rao等[13]以各類型高粱的未成熟胚為研究對象，通過組織培養(yǎng)誘導(dǎo)出愈傷組織，經(jīng)過分化成功獲得再生植株。其中Gamborg等[7]、Dunsant等[8-9]、Brettel等[10]各選用不同的雜交種，在現(xiàn)有培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加內(nèi)源激素誘導(dǎo)出愈傷組織。Rao等[13]研究在MS培養(yǎng)基中添加2,4-D和不同濃度的天門冬酞氨(L-Asn)和脯氨酸(L-Pro)對高粱愈傷組織誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)高濃度的L-Asn和L-Por較低濃度的L-Asn和L-Por促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化的效果強(qiáng)。Ekoinn等[14]以未成熟胚為研究對象，研究在現(xiàn)有培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加其他物質(zhì)對高粱再生植株誘導(dǎo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MS培養(yǎng)基中添加1～5 mg/L 2,4-D，或添加1 mg/L IAA和0.1 mg/L KT混合物，或添加0.1 mg/L KT，或1 mg/L NAA和0.5 mg/L的6-BA混合物，或N6培養(yǎng)基中添加高濃度的天門冬氨酸和脯氨酸均獲得胚性愈傷組織。Ma等[11]、Lusardi等[12]深入研究了不同基因型高粱在形成愈傷組織上的差異及機(jī)理。

國內(nèi)學(xué)者也做了大量工作，如馬鴻圖[15]選取20個(gè)遺傳來源不同的高粱品種，進(jìn)行幼胚培養(yǎng)，結(jié)果得到5個(gè)未成熟胚的小盾片愈傷組織，又經(jīng)過分化獲得了大量再生植株。郭建華[16]以未成熟胚為對象進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)的最適處理時(shí)間及生理機(jī)理研究，結(jié)果表明，高粱未成熟胚的最適胚齡為授粉后的12～13 d，長約1.0 mm；如要提高成功率，處理時(shí)間及胚的大小十分關(guān)鍵，進(jìn)一步研究表明再生植株后代中蛋白質(zhì)含量高于對照親本，單寧含量顯著低于對照親本。建議選取親本時(shí)應(yīng)測定蛋白質(zhì)含量及單寧含量，選取蛋白質(zhì)含量高、單寧含量低的品系。韓福光等[5]研究發(fā)現(xiàn)，未成熟胚的誘愈率在不含有鹽類物質(zhì)的MS培養(yǎng)基中比含有鹽類物質(zhì)的高，可達(dá)70.2%，最適處理時(shí)間為授粉后12～15 d，同時(shí)還研究不同濃度2,4-D對誘導(dǎo)的影響，結(jié)果表明不同濃度2,4-D誘導(dǎo)的結(jié)果不同，因此認(rèn)為2,4-D濃度對結(jié)果有影響。白志良等[17]研究表明，幼胚誘導(dǎo)的成功率較低主要與胚齡相關(guān)，一般胚齡小于7 d的成功率很低，胚齡多余10 d的成功率較高。

1.2 成熟胚培養(yǎng)國外學(xué)者對利用成熟胚進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究較多。Bhaskaran等[18]首次利用高粱成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織，并獲得成功。此后又有學(xué)者利用成熟胚小盾片誘導(dǎo)成功愈傷組織，并分化得到再生植株[19-21]。Cai等[22]以高粱成熟胚的芽端為對象，誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加濃度150 mg/L L-Asn、5 mg/L KT和5種無機(jī)鹽，大大增加成功率，可見添加外源物質(zhì)是增加誘導(dǎo)成功率的有效途徑。

國內(nèi)對于利用成熟胚的研究較少，僅有少數(shù)學(xué)者進(jìn)行相關(guān)研究。韓福光等[5]取幾種高粱類型的不同外植體在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)影響外植體愈傷組織形成和生長的因素很多，結(jié)果表明，不同基因型間愈傷組織誘導(dǎo)率有差異，耐性(耐旱)品種形成愈傷組織能力較強(qiáng)，不同外植體間誘愈率差別較大，幼穗誘愈率最高88.0%，花藥最低1%左右。另外，幼葉誘愈培養(yǎng)對鹽反應(yīng)敏感，在成熟胚培養(yǎng)過程中，其誘愈率為63.0%,并獲得8棵成株。白志良等[17]研究表明，成熟胚的最高出愈率達(dá)100%。石太淵等[23]認(rèn)為基因型和培養(yǎng)基對高粱成熟胚離體培養(yǎng)均有較大影響。

2 幼葉培養(yǎng)

對于利用幼葉誘導(dǎo)愈傷組織的研究國內(nèi)外已有報(bào)道，Wernicke等[24]用葉齡10 d的高粱幼苗幼葉為對象，將其接種在MS培養(yǎng)基上，35 d后得到愈傷組織，后得到再生植株。Sairam等[25]利用8個(gè)不同遺傳來源的高粱品系，選取生長18 d幼苗的幼葉，提取其葉肉細(xì)胞后，接種在添加2,4-D和NAA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行液體培養(yǎng)，得到愈傷組織后，在MS固體培養(yǎng)基上接種，僅2個(gè)品種能分化得到再生植株，誘導(dǎo)率為25%。韓福光等[5]選取距離生長點(diǎn)0.1～1.0 cm的幼葉，先切成1～2 mm段，研究有鹽和無鹽條件下對誘導(dǎo)愈傷組織的影響，結(jié)果表明在有鹽的MS培養(yǎng)基上的誘愈率小，在無鹽的MS培養(yǎng)基上所獲得的誘愈率大。在相同條件下，不同品系間誘導(dǎo)率也不同。上述的研究均是在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行的，對于其他培養(yǎng)基的研究未見報(bào)道。

3 莖尖培養(yǎng)

Nahdi等[26]選取11個(gè)不同遺傳來源的高粱品系的莖尖，培養(yǎng)后的成功率最低為0，最高為91%，可見不同遺傳背景的品系其誘導(dǎo)率不同，表明基因型對結(jié)果的影響巨大。Seetharama等[27]認(rèn)為利用3個(gè)高粱品種的莖尖進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果與Nahdi等[26]的類似，再生率不同，平均為14%，其中僅有2個(gè)品種的再生率為18%以上。白志良等[17]先切取長0.5 cm的切段進(jìn)行誘導(dǎo)，其出愈率為11%左右，說明在莖尖培養(yǎng)中無菌芽的長度非常重要，當(dāng)芽長小于2 cm時(shí)，培養(yǎng)效果隨芽長的減小而變好，但并非越小越好，切取芽的長度還應(yīng)進(jìn)一步研究。

4 幼穗培養(yǎng)

國外學(xué)者Beretl等[28]于1980年進(jìn)行幼穗培養(yǎng)成功。此后George等[29]、Cai等[30]和Kaeppler等[31]針對不同的材料運(yùn)用相同的技術(shù)，即以幼穗為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，進(jìn)而獲得再生植株，均獲得成功。說明利用幼穗誘導(dǎo)愈傷組織簡便易行，成功率高，植株生長速度快。

國內(nèi)學(xué)者[5，17，32]也做了大量的工作，結(jié)論與之相同。其中，韓福光等[5]在幾種不同高粱培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上添加一定濃度的2,4-D和KT，與不添加2,4-D和KT的培養(yǎng)基相比，出愈率明顯提高，由8%提高至10.0%，說明培養(yǎng)基的配方對結(jié)果有較大影響，并要注意取材時(shí)間。

5 花藥培養(yǎng)

Rose[33]對不同基因型的高粱花藥進(jìn)行培養(yǎng)，僅得到白化幼苗。錦州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所[34]選取花藥分化發(fā)育期的4分體期、單核早期、單核晚期和雙核期接種，結(jié)果表明，出愈率0.55%,分化出36株綠苗，分化率為88 %。韓福光等[5]將花藥接種在MS和C17培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)有些材料僅在MS培養(yǎng)基上得到愈傷組織，有些在MS和C17培養(yǎng)基上均無法得到愈傷組織，說明材料的基因型和培養(yǎng)基類型均對培養(yǎng)結(jié)果有重大影響。

6 種子培養(yǎng)

Maralappanvar等[35]在MS培養(yǎng)基中添加一定濃度的2,4-D，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)品種愈傷組織誘導(dǎo)率較高，均在80%以上，如培養(yǎng)基中蔗糖含量達(dá)60 g/L以上，誘導(dǎo)率則更高，劉明等[36]在MS培養(yǎng)基中添加2,4-D和KT，同樣能提高誘導(dǎo)率，白志良等[17]認(rèn)為種子的誘愈率為28%～93%，隨不同品種誘愈率有差異。

7 幼苗培養(yǎng)

Bhat等[21]利用萌發(fā)的無菌苗進(jìn)行培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率僅為34.6%，且未能培養(yǎng)出再生植株。國外學(xué)者以無菌幼苗下的橫向薄細(xì)胞層進(jìn)行培養(yǎng)，獲得成功，但試驗(yàn)條件很高，重復(fù)性較差[36]。

8 原生質(zhì)體培養(yǎng)

衛(wèi)志明等[37]首次報(bào)道高粱原生質(zhì)體培養(yǎng)成功，分別利用高粱植株幼穗胚性愈傷組織建立懸浮細(xì)胞系，分離原生質(zhì)體，經(jīng)培養(yǎng)獲得部分再生植株，田間的生長狀況良好。

9 胚乳培養(yǎng)

田立忠等[38]利用高粱未成熟胚乳在含有BA或2,4-D與KT組合的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)啟動，誘導(dǎo)形成愈傷組織的適宜激素有以下3種：①2,4-D0.5 mg/L，NAA0.2 mg/L，BA0.7 mg/L，KT4 mg/L；②NAA0.5 mg/L，ZT1 mg/L；③2,4-D0.5 mg/L，KT1 mg/L，說明胚乳愈傷組織有較強(qiáng)的分生能力。

10 展望

高粱組織培養(yǎng)的成功受到許多因素的影響。不同基因型、不同培養(yǎng)基均存在差異；研究表明幼胚是理想的外植體,但取材有時(shí)間、部位限制；培養(yǎng)基中添加的外源物質(zhì)也影響高粱愈傷組織誘導(dǎo)與再生。因此,必須對細(xì)胞內(nèi)外多種調(diào)控因子的機(jī)理作深入研究,以最終揭示高粱再生細(xì)胞分化過程的本質(zhì)。

[1] 官華忠,祁建民,周元昌,等.淺析中國高粱的起源[J].種子,2005,24(4):76-79.

[2] 高士杰,李繼洪,李玉發(fā).高粱——大有發(fā)展?jié)摿Φ娘暳献魑颷J].牧草與飼料,2007,1(1)：23-24.

[3] 朱凱,盧慶善,王艷秋.高粱產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)摿\析[J].中國農(nóng)技推廣,2005(7):10-12.

[4] 盧慶善.高粱學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1999：429-433.

[5] 韓福光,張穎.高粱不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),1993(1):45-48.

[6]MASTELLER V J，HOLDEND J.The growth and organ formation from Callus tissue of sorghum[J].Plant Physiology,1970,45:362-364.

[7]GALNLLORG O L,SHYLUK J P,BAR D S,et al.Moprhogenes and Plant regeneration from callus of immature embryos of sorghum[J].Plant Sci Lett,1977(10):67-74.

[8]DUNSANT D I,SHORT K C,THOMAS E.The anatomy of secondary moprhogenesis in culuterd scuetllum tissues of Sogrhum bicolor[J].Porloplasma,1978,97:251-260.

[9]DUNSANT D I,SHORT K C,DHALIWAL H,et al.Fuhlter studies on Plantlet Produciton from cultured tissues of Sogrhum bicolor[J].Porloplasma,1979,101:355-361.

[10] BERETLL R I,WEINREKE W,THOMAS E.Embryogenesis from cultured immature inflorescences of Sorghum bicolor[J].Portoplasm,1980,104:141-148.

[11] MA H,GU M,LIANG G H.Plant regeneration from cultured immature embryos ofSorghumbicolor(L.)[J].Moench Theor Appl Genet,1987,73:389-394.

[12] LUSARDI M C,LUPOTTO E.Somatic embryogenesis and Plant regeneration inSorghumspecies[J].Maydica,1990,35:59-66.

[13] RAO A M,SERE K P,KISHOR P B K.Enhanced Plant regeneration in grain and sweet sorghum by asparagines,proline and cefotaxime[J].Plant Cell Rep,1995,15:72-75.

[14] ELKONIN L A,LOPUSHANSKAYA R F,PAHKOMOVA N V.Initiation and maintenance offriable,embryogenic callus of sorghum(Sogrhumbibolor(L.)Moeneh)by amino acids[J].Maydica,1995,40:153-157.

[15] 馬鴻圖.高粱幼胚培養(yǎng)及再生植株變異的研究[J].遺傳學(xué)報(bào),1985,12(5):350-357.

[16] 郭建華.高粱幼胚小盾片愈傷組織的誘導(dǎo)及其再生植株性狀的變異分析[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),1989(3):7-14.

[17] 白志良,王良群,鄭立萍,等.高粱不同外植體離體培養(yǎng)[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),1995,10(1):60-63.

[18] BHASKARAN S,SEHERTZ K,SILTH R H.Conotrl of morphogenesis in sorghum by 2,4-Dichlorophenoxya-cetic acid and cytokinins[J].Plant Physiology,1983,72 (Supplement):142-143.

[19] HAGIO T.Varietal difference of plant regeneration from callus of sorghum mature seed[J].Sorghum Newsletter,1987,30:92-97.

[20] MURTY U R .Developing tissue culture system for sorghum[J].Sorghum Newsletter,1987,30:12-13.

[21] BHAT S,KURUVINASHEIT M S.Plant regeneration from tissue cultures of cytoplasmic genetic male-sterility maintainer lines of sorghum(Sogrhumbicolor)[J].India Journal of Agriculutarl Sciences,1995,65(20):127-129.

[22] CAI TISHU,BARBARA DALY,LARRY BUDER.Callus induction and plant regeneration from shoot portions of mature embryos of high tannin sorghum[J].Palnt Cell,Tissue and Ogran Culture,1987,9:245-252.

[23] 石太淵,楊立國,王穎.基因型和培養(yǎng)基對高粱幼穗離體培養(yǎng)的影響[J].國外農(nóng)學(xué)-雜糧作物,1995(2):27-29.

[24] WERNICKE W,POTRYKUS L,THOMAS E.Morphogenesis from cultured leaf tissue of Sorghum bicolor-The morphogenetic pathways[J].Portoplasma,1982,111:53-62.

[25] SAIRAM R V,SEHTARAMA N,DEVI P S A,et al.Culture and regeneration of mesophyll-derived protoplasts of sorghum[Sogrhumbicolor(L.)Moench][J].Planre Cell Rep,1999,18:972-977.

[26] NHADI S,WET J M J.In vitro regeneration of Sogrhum bicolor Lines from shoot apices[J].Int Sorghum & Millets Newsletter,1995,36:88-90.

[27] SEETHARAMA N,SAIRAM R V,RANI T S.Regeneration of sorghum from shoot tip cultures and field performance of the progeny[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2000,61:169-173.

[28] BERETLL R L S,EMCKE W,THOMAS E.Embryogenesis from cultured immature inflorescences of Sorghum bicolor[J].Protoplasm,1980,104:141-148.

[29] GEOGE L,EAPEN S.Plant regeneration by somatic embryogenesis from immature inflorescene cultures of Sogrhum almum[J].Ann Bot,1988,61:589-561.

[30] CAI T,BUTLER L.Plant regeneration from embryogenic callus initiated from immature inflorescences of several high-tannin sorghums[J].Plant Cell Tiss,Org Cult,1990,20:101-110.

[31] KAEPPLER H F,PEDERSEN J F.Evaluation of 41 elite and exotic inbred sorghum genotypes for high quality callus production[J].Palnt Cell Tiss Org Cult,1997,48:71-75.

[32] 衛(wèi)志明,許智宏.高梁原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株[J].植物生理學(xué)通報(bào),1989(6):45-46.

[33] ROSE J B.Plant regeneration from embryogenic callus initated from immature inflorescence of several high-tannin sorghum[J].Plant Cell,Tissue and Ogran Culture,1986,6:16-22.

[34] 錦州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所.高粱花藥培養(yǎng)研究初報(bào)[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),1978(5):19-20.

[35] MARALAPPANVAR M S,KURUVINASHETTI M S,HARTI C C.Regeneration,establishment and evaluation of somaclones inSorghumbicolor(L.)Moench[J].Euphytica,2000,115:173-180.

[36] 劉明,趙琦.誘導(dǎo)突變高粱愈傷組織初探田[J].生物技術(shù)通報(bào),2004(4):47-52.

[37] 衛(wèi)志明,許智宏.高粱原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株[J].植物生理學(xué)通訊,1989(6):45-48.

[38] 田立忠,徐愛菊.高粱未成熟胚乳培養(yǎng)的研究[J].遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2000,23(4):398-400.

Application Progress of Tissue Culture in Sorghum

LIU Yong, WANG Liang-qun, YANG Wei et al

(Sorghum Institute of Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Jinzhong, Shanxi 030600)

The research progress of sorghum tissue culture was introduced from aspects of embryo culture,young leaf culture,shoot tip culture,immature inflorescence culture,anther culture, seed culture,seedling culture,protoplast culture,endosperm culture. The development of sorghum tissue culture was forecasted.

Tissue culture; Sorghum; Application

劉勇(1976- )，男，山西榆社人，助理研究員，從事高粱新技術(shù)育種研究。

2015-03-05

S 514

A

0517-6611(2015)10-031-03