樊守艷 王楊 張曉燕 韋 祎 王繼浩*

(1.海南醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 海南?？?571199;2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理及病理生理學(xué)系 北京 100191;3.海南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院 海南?？?571199)

FAM3(family with sequence similarity 3)家族是通過(guò)計(jì)算機(jī)模型在基因庫(kù)中搜索含四螺旋束結(jié)構(gòu)的細(xì)胞因子時(shí)發(fā)現(xiàn)的一組新的細(xì)胞因子家族,共有4個(gè)家族成員:FAM3A,FAM3B,FAM3C和FAM3D,各編碼一含224-235氨基酸的多肽。人FAM3C基因定位于7號(hào)染色體(7q31)[1]。小鼠FAM3C 基因長(zhǎng)度約為50kb,位于染色體6A3.1,含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子。人和小鼠FAM3C基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在包括Nkx5.1、Sp1、Ap1、Ap2和GCbox在內(nèi)的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn),存在含有2個(gè)保守的甘氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域(GGdomain)[2]。

FAM3C為白細(xì)胞介素樣上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)因子(interleukinlike epithelial-mesenChymal transition induCer ,ILEI),已被證明是參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生的重要細(xì)胞因子[3],廣泛表達(dá)于多種組織,在多種臨床疾病中發(fā)揮重要作用。研究表明,FAM3C在胚胎內(nèi)耳細(xì)胞變異和增殖,脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜的形成進(jìn)程中起到重要的作用,在癲癇、肝癌的發(fā)病中也具有非常重要的意義。本研究建立了高效表達(dá)FAM3C基因的病毒表達(dá)系統(tǒng),為進(jìn)一步探討FAM3C在各組織器官中的作用提供重要的研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

p A d E a s y-1腺病毒骨架質(zhì)粒、含有綠色熒光蛋白標(biāo)記pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒購(gòu)自德國(guó)Merck公司。大腸桿菌JM109及BJ5183由本實(shí)驗(yàn)室保存。TaqDNA聚合酶、BglⅡ、PmeI、PacI、NotI以及脫氧核糖核酸(DNA)等酶購(gòu)自TaKaRa公司。核糖核酸(RNA)抽提試劑盒購(gòu)自武漢博士的生物試劑公司。引物由北京華大基因研究中心合成。人胚腎細(xì)胞系HEK293由本實(shí)驗(yàn)室保存。KM小鼠由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及模板的制備

根據(jù) GenBank中小鼠FAM3C基因序列(NM-IL216CDNA)設(shè)計(jì)一對(duì)F A M 3 C基因引物。引物序列為:上游引物5′-CGGGAGCGGCCG CTGGAGAC-3′;下游引物5′-AAGCAAGAGCGGCCGCAAG-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度約707bp,劃線部分為NotI的酶切位點(diǎn)。取KM小鼠5只(20-25g),腹部用75%酒精消毒后,切開(kāi)取兩側(cè)腎臟,放入EP管中,并迅速投入液氮罐中保存,用試劑盒提取RNA,用分光光度計(jì)測(cè)試其濃度并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用上下游引物,以小鼠腎臟 cDNA 作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用五個(gè)退火溫度梯度:57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃。RTPCR顯示,其最佳退火溫度為57oC。瓊脂糖凝膠電泳鑒定,凝膠回收,純化目的基因。

1.2.2 骨架質(zhì)粒的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶NotI切開(kāi)骨架載體pEASY-1,用T3連接酶連入凝膠回收純化的FAM3C,構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pEASY-T3-FAM3C。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ColiJM109 Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中,鋪板(含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)板),37℃孵育過(guò)夜。挑取大而飽滿的克隆,入氨芐LB培養(yǎng)液中,搖菌13h。BglII酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并送奧科公司測(cè)序。

圖1 構(gòu)建重組腺病毒過(guò)程

圖2 pAd-FAM3C感染HEK293細(xì)胞

1.2.3 穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

用NotI酶切pEASY-T3-FAM3C載體, 獲得的目的基因片段,去磷酸化處理后的pAdTraCk-CMV,采用NotI酶切,T4連接酶連接,構(gòu)建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTraCk-CMV-FAM3C。連接體系轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Trans5a,并鋪板過(guò)夜。挑全部單克隆菌落,搖菌過(guò)夜,使其濃度達(dá)到OD600=0.5。菌液PCR鑒定,提取質(zhì)粒。經(jīng)BglⅡ酶切鑒定,酶切后產(chǎn)物凝膠電泳鑒定,并將提取質(zhì)粒送奧科公司測(cè)序。由于使用的是單酶切,需要鑒定連接方向。使用克隆全長(zhǎng)時(shí)的引物序列進(jìn)行測(cè)序,用Han-DNAMAN6.0軟件分析,選擇連接方向正確的產(chǎn)物。

1.2.4 重組腺病毒載體Ad-FAM3C的構(gòu)建

PmeI酶切重組pAdTraCk-CMV-FAM3C,進(jìn)行線性化處理,酚-氯仿-異戊醇抽提。取50ul BJ5183-pAdEasy-1 與5ul PmeIPtraCk-Cmw-Peasy-T3-FAM3C,在2500V,200 Ohms,25miCro-FS,時(shí)間4.4S條件下,電穿孔共轉(zhuǎn)化 BJ5183感受態(tài)菌。將產(chǎn)物放入1mlLB 溶液中并移取200 ul分別鋪入四個(gè)培養(yǎng)皿中,37℃ ,24h。選取陽(yáng)性克隆入含有氨芐青霉素的LB 溶液中,擴(kuò)增并提取質(zhì)粒, PaCI酶切鑒定重組質(zhì)粒,瓊脂糖凝膠電泳分析酶切圖譜,證實(shí)FAM3C基因正確重組入腺病毒載體,將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化至DH5α中進(jìn)行大量擴(kuò)增,抽提制備大量Ad-FAM3C DNA。

1.2.5 重組腺病毒 Ad-FAM3C的包裝及擴(kuò)增

PaCI酶切質(zhì)粒過(guò)夜,瓊脂糖凝膠電泳確定酶切完全,定量測(cè)定線性DNA濃度。異丙醇沉淀回收線性化DNA。按陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染lipofeCtamine 2000 4ul加DNA 2ug,加入60%覆蓋率HEK293細(xì)胞中,37OC，培養(yǎng)細(xì)胞7天,顯微鏡下觀察細(xì)胞全部變圓漂起,熒光顯微鏡下觀察,細(xì)胞內(nèi)顯綠色熒光,收集上清和細(xì)胞,反復(fù)凍融3次,裂解細(xì)胞釋放病毒,以病毒懸液為模板,用 PCR 檢測(cè)其中是否含有FAM3C片段。將鑒定好的腺病毒感染 HEK293細(xì)胞。5天出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng) (CytopathiC effeCt,CPE),待大部分出現(xiàn) CPE后,收集上清和細(xì)胞。用 IC50組織半感染法測(cè)定所獲得病毒的滴度。

1.2.6 Western blot檢測(cè)重組腺病毒介導(dǎo)的FAM3C蛋白的表達(dá)

以感染濃度為7 5 MOI的重組腺病毒感染小鼠腎系膜細(xì)胞(Mouse glomerular mesangial Cells,MMCs),24h后用蛋白裂解液于冰上裂解細(xì)胞,把細(xì)胞連同液體一起吸出入,超聲處理,4℃高速離心收集上清。測(cè)定蛋白濃度,算出相應(yīng)的總蛋白含量。將定量后的蛋白裂解液加上樣緩沖液處理,SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,以兔抗小鼠FAM3C的抗體作為一抗(使用濃度1:800),以HRP標(biāo)記的羊抗兔的抗體為二抗(使用濃度1:4000),采用Western blot法檢測(cè)重組腺病毒介導(dǎo)的FAM3C蛋白在小鼠腎臟系膜細(xì)胞中的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒的構(gòu)建過(guò)程

瓊脂糖凝膠電泳鑒定,利用引物,PCR 擴(kuò)增得到全長(zhǎng)為707bp的 FAM3C目的基因片段(圖1-A)。BglⅡ單酶切后,有兩條電泳條帶,一條337pb為正向連接,另一條4500 bp,為pEASY-1載體,序列分析結(jié)果顯示,小鼠 FAM3C基因已經(jīng)成功克隆入pEASY-1載體內(nèi)(圖1-B)。PacI酶切后,得到兩條電泳條帶,一條為FAM3C的DNA條帶,約707bp; 一條為pAdTrack-CMV載體,約4500bp, 質(zhì)粒測(cè)序,經(jīng)Han-DNAMAN6.0軟件分析序列正確。表明攜帶目的基因的穿梭質(zhì)粒已經(jīng)整合到腺病毒的基因組中(圖1-C),重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 重組腺病毒的包裝及其在腎小球系膜細(xì)胞中的鑒定

經(jīng)線性化處理的重組腺病毒質(zhì)粒以Li-pofeCtamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染60%貼壁的HEK293細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察,顯示綠色熒光,第7天出現(xiàn)細(xì)胞病變(CytopathiC effeCts,CPE),表現(xiàn)為貼壁細(xì)胞變圓、變大,核濃縮和成串脫落,出現(xiàn)病毒空斑(圖2-A),收集細(xì)胞。于-80℃及室溫反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞, 離心后收集含病毒的上清。用75MOI的重組腺病毒Ad-FAM3C感染小鼠腎小球系膜細(xì)胞(MMCs),以不感染FAM3C重組腺病毒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。病毒感染48h后,收集蛋白,進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示,重組腺病毒介導(dǎo)的FAM3C基因在腎小球系膜中高效表達(dá)。而對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)僅檢測(cè)到少量FAM3C蛋白的表達(dá)(圖2-B)。由此證明構(gòu)建的FAM3C病毒能夠在宿主細(xì)胞腎系膜中高效表達(dá) FAM3C。

3 討論

FAM3家族是一個(gè)新的細(xì)胞因子家族,對(duì)該家族成員的研究剛剛起步[4]。對(duì)FAM3C的研究報(bào)道,主要集中于FAM3C基因定位,分子結(jié)構(gòu),表達(dá)和分泌的調(diào)節(jié)以及F AM3 C與肝癌的關(guān)系,目前FAM3C的生物學(xué)功能尚不清楚[5]。

有研究通過(guò)原位雜交的方法揭示,第15.5天小鼠胚胎內(nèi)耳半規(guī)管的非感覺(jué)內(nèi)皮中,存在FAM3C的優(yōu)勢(shì)表達(dá),并且這種表達(dá)形式類似于我們已知的Nkx5.1同源基因。由于Nkx5.1在半規(guī)管發(fā)育中起重要作用,通過(guò)分析啟動(dòng)子區(qū)域,推測(cè)FAM3C是Nkx5.1轉(zhuǎn)錄因子的下游靶基因,并且在胚胎內(nèi)耳細(xì)胞變異和增殖中起到非常重要的作用［6］。研究發(fā)現(xiàn),FAM3C在視網(wǎng)膜細(xì)胞中高度表達(dá),尤其是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。缺失FAM3C,則可導(dǎo)致視網(wǎng)膜光感受細(xì)胞缺失。而細(xì)胞層的不同不會(huì)影響FAM3C的功能。證明FAM3C關(guān)系到脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜的形成進(jìn)程［7］。資料表明通過(guò)蛋白組學(xué)研究顳葉性癲癇時(shí),對(duì)腦脊液進(jìn)行二維電泳和高效液相色譜-電子質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)病人FAM3C表達(dá)顯著降低,提示在該基因在癲癇的發(fā)病中具有一定作用,可作為癲癇病治療的可能作用靶點(diǎn)［8］。Lahsnig等[9］研究表明,FAM3C可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化,過(guò)度表達(dá)原癌基因從而在肝癌的發(fā)生中起著重要作用。實(shí)驗(yàn)通過(guò)誘發(fā)永生化肝細(xì)胞上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型,通過(guò)顯性失活的方法,發(fā)現(xiàn)FAM3C聯(lián)合原癌基因Ras過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)依賴性上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化,其作用通過(guò)PDGF(血小板源性生長(zhǎng)因子)-R/β-Catenin and PDGF-R/Stat3 信號(hào)通路。并認(rèn)為FAM3C可能取代轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)而成為惡性腫瘤發(fā)生的信號(hào)。而這一作用機(jī)制表明,FAM3C與非酒精性脂肪肝的發(fā)病也密切相關(guān)[10]。

本研究首先從小鼠肝臟中克隆出 FAM3C cDNA,利用不同的酶切位點(diǎn)再將FAM3C克隆至pAdEasy骨架載體上,構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒p A d E a s y-F A M 3 C。經(jīng)酶切后將其克隆至重組pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒中。經(jīng)鑒定后反復(fù)轉(zhuǎn)染 HEK 293細(xì)胞,進(jìn)行重組腺病毒載體的包裝及擴(kuò)增。經(jīng)檢測(cè)病毒滴度后感染小鼠腎小球系膜細(xì)胞。pAdEasy-FAM3C自身攜帶綠色熒光蛋白基因,熒光顯微鏡觀察到轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)均有特異性綠色的熒光蛋白的表達(dá),以Western blot法證實(shí)FAM3C在小鼠腎系膜細(xì)胞中的高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)為FAM3C的基礎(chǔ)性研究,為進(jìn)一步闡明FAM3C的功能及作用機(jī)制,探討其病理生理意義起著重要的作用。

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[10]Yang J,Guan Y, “Family with sequence similarity 3 gene family and nonalcoholic fatty liver disease,” Journal of gastroenterology and hepatology. vol. 28, pp. 1105-1111, Aug 2013.