楊 穎，殷愛(ài)紅，武文琦，趙春娟，趙君朋(首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心，北京 00069;首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系;通訊作者，E-mail:jp75@63.com)

鈣離子Ca2+是最簡(jiǎn)單也是最復(fù)雜的細(xì)胞信使，快速變化的細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)與肌肉收縮、神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)、激素分泌等重要生理過(guò)程直接相關(guān)［1，2］。異常變化的鈣信號(hào)在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用［3］。鈣信號(hào)的檢測(cè)廣泛應(yīng)用于鈣信號(hào)偶聯(lián)的細(xì)胞功能以及小分子藥物篩選等研究領(lǐng)域。由于胞質(zhì)Ca2+濃度很低，而且變化迅速，因此，準(zhǔn)確檢測(cè)Ca2+濃度比較困難。目前研究細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)變化主要借助于具有高選擇性、高靈敏度和高時(shí)間分辨率的Ca2+指示劑。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生變化時(shí)，其熒光發(fā)射強(qiáng)度(如Fluo-3、Fluo-4、Indo-5F等)或熒光激發(fā)波長(zhǎng)(如Fura-2)會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變。共聚焦顯微鏡等成像系統(tǒng)是目前檢測(cè)鈣信號(hào)的主要儀器［4，5］。該技術(shù)通過(guò)細(xì)胞成像，檢測(cè)個(gè)體細(xì)胞的熒光強(qiáng)度變化，雖然靈敏度高，但個(gè)體細(xì)胞之間鈣信號(hào)差異大，很難進(jìn)行組間細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其次，后期數(shù)據(jù)處理繁瑣。EnVision多標(biāo)記讀板儀是目前國(guó)內(nèi)外熒光檢測(cè)速度和靈敏度最高的酶標(biāo)儀之一，并且該儀器配有雙通道自動(dòng)加樣器，可以進(jìn)行動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，更為重要的是，其具有高通量檢測(cè)性能，可以提高多樣本檢測(cè)的工作效率，從理論上看，這些優(yōu)良的檢測(cè)性能可以彌補(bǔ)成像技術(shù)的不足。然而，至今尚無(wú)關(guān)于應(yīng)用EnVision多標(biāo)記讀板儀檢測(cè)鈣信號(hào)方面的報(bào)道。本次試驗(yàn)旨在利用該儀器建立一套快速、穩(wěn)定和靈敏的細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)檢測(cè)技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DMEM干粉培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶購(gòu)自美國(guó) HyClone公司，F(xiàn)luo-4/AM購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司，卡巴膽堿、凝血酶和U73122購(gòu)自美國(guó)Calbiochem公司。

1.1.2 細(xì)胞 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN229和神經(jīng)元母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SKN-MC購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 儀器 3111型 CO2培養(yǎng)箱和1300 Series A2型生物安全柜，美國(guó)ThermoFisher科技有限公司;DMIL型倒置顯微鏡，德國(guó)Leica公司;EnVision多標(biāo)記讀板儀，美國(guó)PerkinElmer公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LN229和 SKN-MC細(xì)胞用含10%胎牛血清和100 U/mL青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)基，傳代一次。

1.2.2 細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)檢測(cè) 將LN229或SKN-MC細(xì)胞以2×104/孔的密度接種于96孔底透黑壁微孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)液，在含有2 μmol/L Fluo-4/AM的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育30 min，加入不含鈣的HBSS緩沖液(內(nèi)含pH 7.4 的 20 mmol/L HEPES、120 mmol/L NaCl、5.4 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、10 mmol/L glucose 和0.2 mmol/L EGTA)，洗2次，置于 EnVision多標(biāo)記讀板儀內(nèi)，通過(guò)自動(dòng)加樣器向孔內(nèi)加入相應(yīng)濃度的卡巴膽堿或凝血酶，使用(500±10)nm的激發(fā)光和(535±15)nm的發(fā)射光濾光片，每5 s由孔底部采集熒光信號(hào)一次，空白對(duì)照組為未染色的細(xì)胞。研究EnVision多標(biāo)記讀板儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的靈敏度時(shí)，分別用 0，2，10，50 μmol/L 卡巴膽堿刺激LN229細(xì)胞;研究凝血酶刺激細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)時(shí)，分別加入0，2 U/ml凝血酶;研究U73122對(duì)鈣信號(hào)的抑制作用，細(xì)胞分別在室溫下用 0，1，5 μmol/L U73122(5 μmol/L為抑制磷脂酶C活性的常規(guī)使用濃度)預(yù)處理10 min后，加入2 U/mL凝血酶。每個(gè)檢測(cè)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取3個(gè)復(fù)孔數(shù)據(jù)的平均值，所得熒光強(qiáng)度數(shù)值FI與刺激前的數(shù)值FI0進(jìn)行標(biāo)化。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 遞增濃度的卡巴膽堿誘導(dǎo)下LN229細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的變化

結(jié)果顯示，作為陰性對(duì)照，未加卡巴膽堿(0 μmol/L)未檢測(cè)到熒光強(qiáng)度的變化。卡巴膽堿濃度低至2 μmol/L亦無(wú)明顯的鈣信號(hào)強(qiáng)度的變化，細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)水平在10 μmol/L或常規(guī)濃度50 μmol/L卡巴膽堿刺激后5 s均達(dá)到峰值，分別上升到基礎(chǔ)水平的3倍或5倍左右，并隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，鈣信號(hào)水平逐漸下降，到80 s時(shí)，降至基礎(chǔ)水平(見圖1)。

圖1 LN229細(xì)胞受不同濃度卡巴膽堿刺激后細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)強(qiáng)度的變化Figure 1 Calcium signaling induced by increasing concentrations of carbachol in LN229 cells

2.2 凝血酶誘導(dǎo)下LN229細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的變化

結(jié)果顯示，與卡巴膽堿刺激相比，在LN229細(xì)胞內(nèi)，凝血酶誘導(dǎo)的鈣信號(hào)上升速度較緩慢，至15-20 s時(shí)達(dá)到峰值，于80 s后降至基礎(chǔ)水平(見圖2)。

圖2 LN229細(xì)胞受凝血酶刺激后細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)強(qiáng)度的變化Figure 2 Thrombin-induced calcium signaling in LN229 cells

2.3 凝血酶誘導(dǎo)下SKN-MC細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的變化

結(jié)果顯示，與LN229細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)比較，SKNMC細(xì)胞內(nèi)凝血酶誘導(dǎo)的鈣信號(hào)上升速度更快，于刺激后10 s達(dá)到峰值，然后迅速減弱，于40 s后降至基礎(chǔ)水平(見圖3)。

2.4 U73122對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的LN229細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的抑制作用

結(jié)果顯示，隨著磷脂酶C抑制劑U73122處理濃度升高，凝血酶誘導(dǎo)的LN229細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱。5 μmol/L U73122完全抑制了凝血酶誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)(見圖4)。

圖3 SKN-MC細(xì)胞受凝血酶刺激后細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)強(qiáng)度的變化Figure 3 Thrombin-induced calcium signaling in SKNMC cells

圖4 U73122抑制作用下凝血酶誘導(dǎo)的SKN-MC細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)強(qiáng)度的變化Figure 4 Inhibitory effect of U73122 on thrombin-induced calcium signaling in SKN-MC cells

3 討論

在真核細(xì)胞中，80%-90%Ca2+儲(chǔ)存于鈣庫(kù)，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞最主要的鈣庫(kù)，在靜息狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的Ca2+濃度比細(xì)胞質(zhì)溶質(zhì)中的濃度高萬(wàn)倍，激活細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)主要是通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)-磷脂酶C(PLC-β)信號(hào)傳遞途徑。GPCR是目前全世界市場(chǎng)上40%-50%處方藥的分子靶標(biāo)，生物對(duì)許多外界刺激，如神經(jīng)遞質(zhì)、激素、味覺(jué)、嗅覺(jué)甚至光線等發(fā)生的反應(yīng)都是通過(guò)GPCR介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)的［6］。PLC-β介導(dǎo)的鈣信號(hào)研究也成為GPCR研究領(lǐng)域中最為活躍的一個(gè)分支［7］。但是，目前細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的檢測(cè)手段有限，主要依賴細(xì)胞成像技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)分別使用GPCR激動(dòng)劑卡巴膽堿或凝血酶激活PLC-β介導(dǎo)的鈣信號(hào)通路，使用PLC-β特異性抑制劑U73122抑制凝血酶誘導(dǎo)的鈣信號(hào)，利用EnVision多標(biāo)記讀板儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的鈣信號(hào)變化。檢測(cè)結(jié)果顯示，卡巴膽堿誘導(dǎo)的LN229細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)變化具有濃度依賴性，卡巴膽堿和凝血酶誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)變化趨勢(shì)不同，此外，凝血酶誘導(dǎo)的鈣信號(hào)變化具有細(xì)胞特異性，U73122對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的鈣信號(hào)的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。由此可見，EnVision多標(biāo)記讀板儀可以作為鈣信號(hào)檢測(cè)的主要儀器使用。

用EnVision多標(biāo)記讀板儀檢測(cè)鈣信號(hào)與常用的細(xì)胞成像技術(shù)相比有許多優(yōu)勢(shì)。首先，從檢測(cè)的靈敏度看，EnVision多標(biāo)記讀板儀使用濾光片系統(tǒng)檢測(cè)微孔內(nèi)細(xì)胞熒光強(qiáng)度總和的變化，不僅能檢測(cè)出激動(dòng)劑或抑制劑與細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)變化的劑量相關(guān)性，而且能區(qū)別不同類細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的差異，因此，與檢測(cè)個(gè)體細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的細(xì)胞成像技術(shù)相比，更適合進(jìn)行小分子抑制劑的篩選及激動(dòng)劑敏感度的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。其次，從檢測(cè)流程考慮，使用EnVision多標(biāo)記讀板儀，從上樣到動(dòng)力學(xué)檢測(cè)的程序已自動(dòng)化，從而減少了多次實(shí)驗(yàn)之間產(chǎn)生差異的可能性，保證了測(cè)試結(jié)果的均一性;同時(shí)，也加快了檢測(cè)速度，不僅最大程度上保留了檢測(cè)細(xì)胞的活力，而且可增加單次檢測(cè)的樣本數(shù)量。最后，從后期數(shù)據(jù)處理的角度分析，使用細(xì)胞成像技術(shù)檢測(cè)，需要通過(guò)相應(yīng)的軟件選取15-20個(gè)細(xì)胞分析并且導(dǎo)出數(shù)據(jù)，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;而使用EnVision多標(biāo)記讀板儀獲得的數(shù)據(jù)可以直接在普通的圖表軟件上分析，較前者便捷，耗時(shí)短。

綜上所述，EnVision多標(biāo)記讀板儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)技術(shù)具有快速、重復(fù)性好、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，適用于PLC介導(dǎo)的鈣信號(hào)通路領(lǐng)域的研究工作。因此，本技術(shù)有著很廣闊的應(yīng)用前景。

［1］Berridge MJ，Lipp P，Bootman MD.The versatility and universality of calcium signalling［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2000，1:11-21.

［2］Clapham DE.Calcium signaling［J］.Cell，2007，131:1047-1058.

［3］Prevarskaya N，Skryma R，Shuba Y.Calciumin tumour metastasis:new roles for known actors［J］.Nat Rev Cancer，2011，11:609-618.

［4］Ishida S，Matsu-Ura T，F(xiàn)ukami K，et al.Phospholipase C-beta1 and beta4 contribute to Non-Genetic Cell-to-Cell Variability in Histamine-Induced Calcium Signals in HeLa Cells［J］.PLoS One，2014，9:e86410.

［5］Kim JK，Kwon O，Kim J，et al.PDZ domain-containing 1(PDZK1)protein regulates phospholipase C-beta3(PLC-beta3)-specific activation of somatostatin by forming a ternary complex with PLC-beta3 and somatostatin receptors［J］.J Biol Chem，2012，287:21012-21024.

［6］Bridges TM，Lindsley CW.G-protein-coupled receptors:from classical modes of modulation to allosteric mechanisms［J］.ACS Chem Biol，2008，3:530-541.

［7］Ritter SL，Hall RA.Fine-tuning of GPCR activity by receptor-interacting proteins［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10:819-830.