王偉，張鵬飛,王丹慧，李梅，于鳳玲，薛峰

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，呼和浩特011500；2.包頭市青山區(qū)興勝鎮(zhèn)政府，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

0 引言

牛奶檢測中經(jīng)常出現(xiàn)抗生素陽性的現(xiàn)象，尤其是磺胺類抗生素，目前，牛奶中磺胺類檢測國標(biāo)方法只有液相色譜-質(zhì)譜連用，價格昂貴，且操作復(fù)雜，無法大范圍推廣，GB 29694-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)動物性食品中13種磺胺類藥物多殘留的測定高效液相色譜法》中檢驗方法適用于肌肉和肝臟組織的檢測，不適用于牛奶中磺胺類藥物殘留的檢測，因牛奶基質(zhì)與肌肉、肝臟不同，導(dǎo)致使用乙酸乙酯進(jìn)行提取，回收率太低，無法滿足要求，因此，進(jìn)行液相方法的研究，使用乙腈提取，旋蒸，轉(zhuǎn)換溶劑，除脂，固相萃取，液相-紫外檢測。實驗方法操作簡單，滿足相關(guān)國標(biāo)要求，且大部分企業(yè)均可滿足實驗條件，可實現(xiàn)廣泛推廣。

1 儀器設(shè)備和耗材

液相色譜儀：配紫外檢測器。

溶劑過濾器：帶有0.45 μm水系濾膜。

天平：萬分之一天平，十萬分之一天平。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：配控溫裝置。

高速離心機(jī)：至少8000轉(zhuǎn)/分。

氮吹儀、漩渦混合器、固相萃取裝置。

離心管（50 mL和15 mL）、100 mL或250 mL旋蒸瓶、刻度吸管（1 mL和5 mL）、一次性塑料吸管（3 mL）、試管（15×150）、水系濾膜（0.22 μm）。

2 試劑

以下所用試劑，除特殊注明外均為分析純試劑，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧噠嗪、苯酰磺胺、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺異噁唑、磺胺二甲氧噠嗪標(biāo)準(zhǔn)品：含量≥99%；磺胺噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品：含量≥98%。

乙腈：色譜純。

甲醇：色譜純。

鹽酸。

正己烷。

甲酸：色譜純。

氨水。

MCX柱：60 mg/3 mL，或相當(dāng)者。

0.1 %甲酸溶液：取甲酸1 mL，用水溶解并稀釋至1 000 mL。

0.1 %甲酸乙腈溶液：取0.1%甲酸830 mL，用乙腈溶解并稀釋至1 000 mL。

洗脫液：取氨水5 mL，用甲醇溶解并稀釋至100 mL。

0.1 mol/L鹽酸溶液：取0.83 mL，用水溶解并稀釋至100 mL。

50%甲醇乙腈溶液：取甲醇50 mL，用乙腈溶解并稀釋至100 mL。

3 測定方法

3.1 樣品處理

3.1.1 稱量和溶解測試樣品

稱5 g(精確到0.01 g)樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋混合2 min，≥8 000 r/min離心5 min，取上清液于100 mL或250 mL旋蒸瓶中，殘渣中加入乙腈20 mL，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。

旋蒸瓶于低于50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干，用0.1 mol/L鹽酸溶液2 mL洗旋蒸瓶，轉(zhuǎn)至15 mL離心管中，再用0.1 mol/L鹽酸溶液2 mL洗一次旋蒸瓶，轉(zhuǎn)至同一離心管中，用正己烷3 mL洗旋蒸瓶，轉(zhuǎn)至同一離心管中，重復(fù)用正己烷3 mL洗一次，轉(zhuǎn)至同一離心管中，渦旋混合30 s，大于等于8 000 r/min離心5 min，棄正己烷層，取下層液備用。

MCX柱依次用甲醇2 mL和0.1 mol/L鹽酸溶液2 mL活化，取備用液過柱，控制流速1 mL/min。依次用0.1 mol/L鹽酸溶液1 mL和50%甲醇乙腈溶液2 mL淋洗，用洗脫液4 mL洗脫，收集洗脫液，于低于50℃氮氣吹干，用0.1%甲酸乙腈溶液1.0 mL溶解殘余物，濾膜過濾，供高效液相色譜測定。

注：如果在檢測過程中發(fā)現(xiàn)，待測樣品的濃度太高，可以將處理樣品用0.1%甲酸乙腈溶液進(jìn)行稀釋，然后再進(jìn)行上機(jī)檢測，在計算時需考慮稀釋倍數(shù)。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密量取10 μg/mL磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用0.1%甲酸乙腈溶液稀釋，配制成濃度為0、100、200、300、400、500 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，供高效液相色譜測定。以測得峰面積為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

備注：可作單點或多點校準(zhǔn)，按外標(biāo)法。

3.2 儀器參考條件

柱溫箱：35℃；

紫外檢測器：270 nm；

進(jìn)樣量：20 μL；

色譜柱：C18（250×4.6 mm，5 μm）或其他性能相當(dāng)者；

流動相：0.1%甲酸+乙腈，梯度洗脫見表1；

流速：1.0 mL/min；

備注：以上儀器條件是參考條件，在實際操作過程中可以根據(jù)樣品特性和儀器狀態(tài)做適當(dāng)調(diào)整。

3.3 檢出限

3.3.1 定性檢出限

磺胺醋酰：10 μg/kg。

磺胺吡啶：10 μg/kg。

表1 流動相梯度洗脫濃度設(shè)置

磺胺甲氧噠嗪：10 μg/kg。

苯酰磺胺：10 μg/kg。

磺胺間甲氧嘧啶：10 μg/kg。

磺胺氯噠嗪：10 μg/kg。

磺胺異噁唑：10 μg/kg。

磺胺二甲氧噠嗪：10 μg/kg。

磺胺甲噁唑：10 μg/kg。

磺胺噁唑：10 μg/kg。

磺胺甲基嘧啶：10 μg/kg。

磺胺二甲基嘧啶：10 μg/kg。

3.3.2 定量檢出限

磺胺醋酰：25 μg/kg。

磺胺吡啶：25 μg/kg。

磺胺甲氧噠嗪：25 μg/kg。

苯?；前罚?5 μg/kg。

磺胺間甲氧嘧啶：25 μg/kg。

磺胺氯噠嗪：25 μg/kg。

磺胺異噁唑：25 μg/kg。

磺胺二甲氧噠嗪：25 μg/kg。

磺胺甲噁唑：25 μg/kg。

磺胺噁唑：25 μg/kg。

磺胺甲基嘧啶：25 μg/kg。

磺胺二甲基嘧啶：25 μg/kg。

4 結(jié)果

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

12種磺胺標(biāo)準(zhǔn)曲線（0 μg/kg ，100 μg/kg，200 μg/kg，300 μg/kg，400 μg/kg，500 μg/kg），相關(guān)系數(shù)R2均大于等于0.998。

（2）回收率。

表3 牛奶中50μg/kg 12種磺胺混標(biāo)加標(biāo)

表4 牛奶中25 μg/kg磺胺二甲基嘧啶加標(biāo)回收率及變異系數(shù)

（3）重復(fù)性。

方法規(guī)定重復(fù)性：在重復(fù)條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不超過算數(shù)平均值的20%,檢測三組平行樣數(shù)據(jù)，結(jié)果如下。

表5 12種磺胺混標(biāo)樣品的重復(fù)性

（4）精密度。

同時做6組陽性平行樣樣品，精密度數(shù)據(jù)見下表6。

表6 12種磺胺類精密度

由此可見，標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率、重復(fù)性、精密度都滿足GB/T 27404中相關(guān)要求。

5 討論

（1）嘗試了丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、正己烷做溶劑萃取，回收率普遍為30%-50%之間。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配，磺胺甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)工作液放置2天后（4℃保存），上機(jī)，明顯不呈線性。

（3）磺胺甲氧噠嗪、磺胺醋酰、磺胺吡啶可能存在干擾，如無法區(qū)分，需用標(biāo)準(zhǔn)加入法判定，或調(diào)整梯度洗脫、更改柱溫、流速等條件。

（4）樣品渦旋混合要混勻，要保證離心效果，否則旋蒸后萃取分層后，中間有大量白色物質(zhì)（可能為蛋白質(zhì)），可能會影響回收率。

[1]GB 29694-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)動物性食品中13種磺胺類藥物多殘留的測定高效液相色譜法》.

[2]萬春花.磺胺類藥物殘留的色譜分析進(jìn)展[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器，2008（2）：1-9.

[3]GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》.