王春梅，李曄，佟慧麗，李惠銘，萬中英，李慶章

（東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

0 引言

越來越多的研究顯示對于乳腺發(fā)育而言，激素與蛋白并不能完美闡釋其發(fā)育過程。近年來，miRNA的研究結果顯示RNAs調(diào)節(jié)了細胞生長，組織分化，因而與生命過程中器官發(fā)育有關[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)miR-335的表達能誘導細胞形態(tài)改變減少細胞運動性，它限制細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[3]。miRNA-101通過調(diào)節(jié)環(huán)氧化酶-2來控制小鼠乳腺發(fā)育，過表達miR-101抑制β-casein mRNA表達[4]。目前miRNAs如何調(diào)控乳腺發(fā)育和泌乳相關基因的表達研究尚少，有研究發(fā)現(xiàn)沉默miRNA-212與miRNA-132后小鼠乳腺導管就完全不能發(fā)育，說明miRNAs的調(diào)控研究對乳腺的發(fā)育與泌乳至關重要[5]。

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是一組絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞的信息傳遞中起重要作用，被激活后可以產(chǎn)生較為廣泛的生物學效應，如誘導細胞增殖分化，活化核轉(zhuǎn)錄因子和細胞表面受體，促進細胞增殖等[8-9]。

在前期實驗發(fā)現(xiàn)miR-138在不同發(fā)育時期的乳腺組織差異表達，本研究進一步以乳腺上皮細胞為模型，探討miR-138在乳腺上皮細胞中的作用機制。

1 實驗

1.1 材料

不同發(fā)育時期昆明小鼠；青春期4周3只，妊娠期9天3只；哺乳期2天3只；退化5天3只。頸椎處死法取乳腺組織。

1.2 qRT-PCR檢測乳腺組織中相關基因的表達

Trizol法抽提乳腺組織總RNA，總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen，具體步驟按說明書操作.取1 ug RNA，用PrimeScript RT reagent Kit（Takara）進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA.TaqMan microRNA assays kit（上海吉瑪）進行miR-138及內(nèi)參5 s的RT-PCR分析，SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）試劑盒檢測PKC、β-actin mRNA表達.引物序列分別為：miR-138及5s引物由上海吉瑪生物有限公司提供；PKC上游：5'-TTGGTCTTGGACACTACGGCTAT-3'，下 游 ：5'-TAGCAAACGGAGACCAGAAGAA-3'；β-actin上游：5'-CCGCAAGGACCTCTACGC-3'，下游：5'-CATGCCAATCTCATCTCGTTTT-3'；引物由華大公司合成.根據(jù)RT-PCR所獲得的各基因Ct值，目的基因的相對表達量計算公式：基因的相對表達量=實驗組目的基因/對照組目的基因=2-△△Ct，其中△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組，△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。

1.3 細胞培養(yǎng)

小鼠乳腺上皮細胞系（MCMECs）由本實驗室建立并保存.應用含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清（Gibco）和抗菌素（100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）的DF-12培養(yǎng)基，5%CO2、37℃培養(yǎng)細胞。

1.4 熒光素酶報告基因活性檢測

利用PCR的方法擴增含有與miR-138互補序列的PKC mRNA 3'UTR一個132 bp的片段，插入到熒光素酶報告載體pMIR-REPORT Luciferase.在上游引物的5'端引入一個HindⅢ酶切位點，在下游引物的5'端引入一個SpeⅠ酶切位點.以下為用于生成特定的片段引物的設計：DNMT1 mRNA 3'UTR上游引物：5'-AAGCTTATGTCAGCCAAGGCCACAA-3'；PKC1 mRNA 3'UTR下游引物：5'-ACTAGTCTATCACCCATGTTTCTGCC-3'標注下劃線的序列表示酶切位點，引物由上海Invitrogen生物技術有限公司合成.

12孔板采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000（Invitrogen）將0.4 μg螢火蟲熒光素酶報告載體和0.08 μg的海腎熒光素酶報告基因載體（phRL-TK）轉(zhuǎn)染到DCMECs中，轉(zhuǎn)染miR-138 mimics和陰性對照片段（韓國Bioneer公司）的最終濃度為100 nmol/L.轉(zhuǎn)染24h以后使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒（Promega）對螢火蟲和海腎熒光素酶活性進行連續(xù)測定.棄掉細胞培養(yǎng)基，每孔細胞先用1×PBS洗2次，加入100 μL 1×細胞裂解液，室溫輕緩晃動15 min后，收集細胞裂解液.預先在熒光測定管中加100 μL LAR II（luciferase assay reagent），再加細胞裂解液20 μL，置于發(fā)光儀中，檢測螢火蟲熒光素酶活性，讀取熒光值.然后向檢測管中繼續(xù)加入100 μL Stop&Glo Reagent，測定海腎熒光素酶活性，讀取熒光值；熒光素酶相對活性以螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性（Firefly/Renilla）的比值表示.實驗進行3次重復.

1.5 miR-138轉(zhuǎn)染MCMECs細胞

將miR-138 minics miR-138 inhibitor（AMO）及相應的陰性對照試劑（上海吉瑪公司合成）與無血清無雙抗的DF-12培養(yǎng)基混合,室溫孵育5 min，加入適量的siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染試劑（上海吉瑪公司），室溫孵育10 min后將miRNA-siRNA Mate復合物分別加入培養(yǎng)板，6 h后檢測轉(zhuǎn)染效率換成完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.6 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染后DCMECs中蛋白表達的變化

轉(zhuǎn)染MCMECs 48 h后，4℃預冷的D-hanks沖洗3遍，加入細胞裂解液冰上裂解抽提細胞總蛋白.BCA法檢測蛋白濃度，取40 μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，在潤濕的半干轉(zhuǎn)移電泳槽中將蛋白轉(zhuǎn)到醋酸纖維膜上，根據(jù)目的蛋白分子量選擇適當?shù)霓D(zhuǎn)膜時間，恒壓20V轉(zhuǎn)膜90 min.5%脫脂乳封閉1.5 h后加入一抗（PKC為兔多克隆抗體，β-casein為兔多抗，內(nèi)參β-actin為鼠多克隆抗體），4℃過夜；TBST洗膜3次，每次5 min；分別加入二抗（HRP標記的羊抗兔、羊抗鼠的二抗）孵育1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；在自封袋中加入配置好的超敏發(fā)光液，并將NC膜裝入其中，在暗室中用X-光片曝光，顯影，定影，掃描結果，用Bandscan4.3圖像分析軟件進行灰度分析.

1.7 對奶牛乳腺上皮細胞分泌β-酪蛋白能力的測定

細胞分泌酪蛋白含量的測定：檢測方法按照酪蛋白β（CSN2）檢測試劑盒（Uscn Life Science Inc.）說明書進行操作，運用雙抗體夾心ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中β-酪蛋白含量。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用BandScand 4.3軟件對Western blotting圖譜進行灰度掃描.使用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，實驗數(shù)據(jù)是以平均值±SD表示，P＜0.05。

2 結果與討論

2.1 不同發(fā)育時期乳腺組織中miR-138的表達

取不同發(fā)育時期乳腺組織的總RNA，采用qRT-PCR方法檢測，結果顯示miR-138在青春期表達增高，妊娠期表達降低（P＜0.01），泌乳期略有增加，到退化期表達量又增高（見圖1）結果提示Mir-138在小鼠乳腺的發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。

圖1 miR-138在不同發(fā)育時期的乳腺組織的表達

2.2 miR-138對PKC3'UTR的調(diào)控作用

雙螢光素酶報告基因載體實驗結果如圖2，PKC3'UTR組的結果和陽性對照組（miR-138 taget）的結果一致，報告基因受到miR-138的調(diào)控，而突變的PKC3'UTR組（mmuMiR-138）報告基因表達不變。

圖2 miR-138對PKC3'UTR的調(diào)控作用

2.3 乳腺上皮細胞miR-138對PKC的調(diào)控作用的表達

miR-138minics和miR-138抑制子轉(zhuǎn)然后的細胞培養(yǎng)48 h后，提取蛋白，western bloting鑒定PKC蛋白的表達，可見miR-138抑制子（AMO）作用的細胞中PKC蛋白表達顯著增高非轉(zhuǎn)染細胞及negative control處理細胞（P＜0.05）；miR-138 minics轉(zhuǎn)然后的細胞結果相反，如圖3所示。

圖3 miR-138在乳腺上皮細胞中對PKC蛋白表達的調(diào)控

2.4 miR-138對乳腺上皮細胞分泌β-酪蛋白的影響

運用雙抗體夾心ELISA法用酪蛋白β（CSN2）檢測試劑盒測定細胞培養(yǎng)液中CSN2含量。根據(jù)β-酪蛋白標準曲線，發(fā)現(xiàn)β-酪蛋白質(zhì)量濃度與OD值呈線性關系，即可用OD值和質(zhì)量濃度比之間關系計算未知樣品中β-酪蛋白質(zhì)量濃度。對檢測結果進行統(tǒng)計分析，結果如表1所示，miR-138抑制劑組中，奶牛乳腺上皮細胞分泌的β-酪蛋白量顯著高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），兩對照組間β-酪蛋白分泌量差異不顯著（P＞0.05）

表1 miR-138 mimics轉(zhuǎn)染后奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白質(zhì)量濃度變化

3 結論

miR-RNA在組織器官發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，我們的實驗結果顯示miR-138在不同的乳腺發(fā)育時期表達量不同，提示MiR-138可能參與乳腺發(fā)育泌乳進程的調(diào)控，繼而驗證了miR-138作用于PKC3'UTR，在乳腺上皮細胞中miR-138負調(diào)控PKC蛋白的表達，因此推論MiR-138在乳腺發(fā)育泌乳過程中可能通過調(diào)控PKC的表達繼而引起乳腺泌乳等功能的改變，詳盡的機理需進一步探討。

[1]BIAN Y,LEI Y,WANG C,et al.Epigenetic Regulation of miR-29s Affects the Lactation Activity of Dairy Cow Mammary Epithelial Cells[J].J.Cell Physiol.，2015（5）：24944-24956.

[2]WANG J,BIAN Y,WANG Z,et al.MicroRNA-152 regulates DNA methyltransferase 1 and is involved in the development and lactation of mammaryglands in dairy cows[J].PLoS One，2014，9（7）：101358.

[3]CHEN B,CHEN X,WU X,et al.Disruption of microRNA-21 by TALEN leads to diminished cell transformation and increased expression of cell-environment interaction genes[J].Cancer Lett.，2015，28：356.

[5]UCAR A,ERIKCI E，UCAR O,et al.miR-212 and miR-132 are dispensable for mouse mammary gland development[J].Nat Genet.，2014，46（8）：804.

[6]YI P,FENG Q,AMAZIT L,et al.Atypical protein kinase C regulates dual pathways for degradation of the oncogenic c oactivator SRC-3/AIB1[J].Mol Cell.，2008，29（4）：465-476.

[7]FENG Q,YI P,WONG J,O'MALLEY B W.Signaling within a coactivator complex：methylation of SRC-3/AIB1 is a molecular switch for complex disassembly[J].Mol Cell Biol.，2006，26（21）：7846-7857.

[8]OH A S,LAHUSEN J T,CHIEN C D,et al.Tyrosine phosphorylation of the nuclear receptor coactivator AIB1/SRC-3 is enhanced by Abl kinase and is required for its activity in cancer cells[J].Mol Cell Biol.，2008，28（21）：6580-6593.

[9]FENG Q,YI P,WONG J,et al.Signaling within a coactivator complex：methylation of SRC-3/AIB1 is a molecular switch for complex disassembly[J].Mol Cell Biol.，2006，26（21）：7846-7857.