徐海紅，林文珍，李錫安，金贏凱，錢慧佶，程志才，盧飛，張少輝b

（1.上海交通大學(xué)a.農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院；b.陸伯勛食品安全研究中心，上海200240；2.浙江熊貓乳業(yè)集團股份有限公司,浙江溫州325800）

0 引言

鑒定生物活性肽所用的方法通常以某種生物活性為導(dǎo)向，多次分離鑒定得到活性強的部分，最終鑒定多肽，如Cristian De Gobba等人[1]鑒定來源于羊奶中的的氧化生物活性肽。然而，該策略會在分離過程中造成損失，忽略低濃度的活性物質(zhì)。特別是，酸奶在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的多肽來源于不同的牛奶蛋白前體[2]，它們間的相對含量之比相差很大，導(dǎo)致某些多肽很難被鑒定得到。

因此，為了得到盡可能多的生物活性物質(zhì)，本文通過簡單的前處理，用模擬胃腸道消化處理發(fā)酵乳，保證得到的肽具有一定的抵制水解的能力，再用超高效液相-質(zhì)譜儀分析，以期得到更豐富、濃度相對較低的多肽物質(zhì)。

1 實驗

1.1 材料

脫脂奶粉，瑞士乳桿菌CICC6024，胃蛋白酶，胰酶，3 ku超濾管，Sep-Pack@C18（50 mg吸附劑）。

1.2 設(shè)備

BJ-2CD超凈工作臺，LRH-250F生化培養(yǎng)箱，GL-22M高速冷凍離心機，ALPHA 1-2-LD真空冷凍干燥機，超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀，G136T型高壓滅菌鍋，RO15純水系統(tǒng)，低溫冰箱。

1.3 方法

1.3.1 樣品的準備

將活化后的菌種瑞士乳桿菌（CICC6024）發(fā)酵劑以質(zhì)量分數(shù)為2%的量接種到質(zhì)量濃度為120 g/L的滅菌脫脂乳中培養(yǎng)，溫度37℃，培養(yǎng)時間7 h，獲得發(fā)酵乳。將發(fā)酵乳裝入離心管中低溫離心（9 000 r/min，4℃）30 min。離心后棄沉淀，取上清液，并將上清液倒入超濾管中，超濾條件：4 800 r/min，4℃，30 min，離心后超濾液備用。

在固相萃?。⊿PE）前，取超濾液用ddH2O稀釋50倍，備用。固相萃取條件根據(jù)Sergio Català-Clariana等人[3]方法稍作修改，固相萃取柱先用乙醇（2 mL）和水（2 mL）活化。上樣（2 mL）后，用400 μL溶液（體積比為80:20(甲醇:水)和體積分數(shù)為0.1%的甲酸）將吸附著的物質(zhì)洗脫下來。在上述所有步驟中，流速大約保持在1 mL/min。洗脫液先用氮吹儀在室溫條件下吹至約5～6 mL后，真空冷凍干燥成粉末，于-80℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

取凍干后粉末樣品進行胃腸道消化模擬實驗，主要步驟按照J.A.Gómez-Ruiz等人[4]的方法，并根據(jù)Quirós A等人[5]的方法修改而來。具體方法：取1.5 mg樣品粉末溶于1.5 mL ddH2O中，在樣品（濃度為1 mg/mL）中加入胃蛋白酶(酶：底物=1:50，質(zhì)量比）后，將pH調(diào)至2.0，37℃水浴90 min。隨后，將水解產(chǎn)物的pH調(diào)至7.5，加入胰酶（酶∶底物=1∶25，質(zhì)量比），37℃水浴150 min。最后，用95℃水浴5 min使酶失活停止反應(yīng)。將樣品真空冷凍干燥，存儲于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用分析

（1）樣品的準備

將1.3.1中得到的樣品溶于100 μ L的ddH2O中，離心后吸取上清液置于樣品瓶，離心條件：12 000 r/min，10 min，置于-4 ℃，備用。

（2）液相色譜條件

儀器為Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀，色譜柱規(guī)格為CSH C18色譜柱，流動相A液為ddH2O，流動相B液為乙腈溶液，流速為0.4 mL/min，溫度為45℃，紫外檢測波長為220 nm，進樣量為5 μL，梯度條件為0～2.5 min保持99%A液，1%B液；2.5～5 min，B液從1%上升至5%，A液從99%下調(diào)至95%；5～10 min，B液從5%上升至10%，A液從95%下調(diào)至90%；10～17 min，B液從10%上升至25%，A液從90%下調(diào)至75%；17～22 min，B液從25%上升至40%，A液從75%下調(diào)至60%；22～27 min，B液從40%上升至80%，A液從60%下調(diào)至20%；27～29 min，B液從80%上升至100%，A液從20%下調(diào)至0%，并保持2 min；31～31.5 min，B液從100%下調(diào)至5%，A液從0%上升至95%；31.5～32 min，B液從5%下調(diào)至1%，A液從95%上升至99%；32～34 min，保持99%A液，1%B液。

（3）質(zhì)譜條件

離子方式為ES+，質(zhì)量范圍為50～2000 m/z；毛細管電壓（Capillary）為3.0 kV；采樣錐為35.0 V；離子源溫度為105℃；去溶劑溫度為350℃；錐孔氣流量為50.0 L/h；去溶劑氣流為：600.0 L/Hr；碰撞能量：6.0 eV；碰撞氣流：0.6 mL/min；掃描時間：0.26 sec；內(nèi)掃描時間：0.02 sec。

1.3.3 多肽序列的鑒定方法

（1）牛奶來源蛋白氨基酸序列庫的建立

蛋白氨基酸序列通過BIOPEP(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep)以及《食品蛋白質(zhì)——結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能》[6]搜索補充完成，包括α s1-酪蛋白（ID：1086-1089，變體A-D），α s2-酪蛋白（ID：1090，變體 A1），β-酪蛋白（ID：1097-1103，變體A1-A3，B，C，E，F(xiàn)），κ -酪蛋白（ID：1117，變體A）,α -乳白蛋白（ID：1115，變體B），β-乳球蛋白（ID：1116，變體 A），乳鐵蛋白（ID：1236），血清白蛋白（ID：1729）。將得到的蛋白氨基酸序列建成一個數(shù)據(jù)庫。

（2）氨基酸序列質(zhì)量的匹對

建立匹配程序，將UPLC-MS分析得到的相對分子質(zhì)量，在牛奶蛋白的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫中進行搜索，得到預(yù)測多肽序列。該匹配程序通過JAVA程序和MySQL數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)，具體實現(xiàn)的要求：輸入由UPLC-MS得到的質(zhì)量，與已建立的數(shù)據(jù)庫中氨基酸序列匹對，輸出相對分子質(zhì)量誤差在±0.01Da內(nèi)的多肽序列、該序列的相對分子質(zhì)量以及該序列的具體蛋白來源。

（3）多肽序列的驗證

通過Biolynx軟件，將1.3.3（2）中預(yù)測得到多肽序列的理論二級質(zhì)譜圖與MS/MS得到的實際二級質(zhì)譜圖對比分析，軟件通過二級質(zhì)譜圖中的離子碎片峰的匹配情況，根據(jù)計算結(jié)果，確認預(yù)測多肽序列。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Masslynx軟件處理質(zhì)譜所得數(shù)據(jù)，提取色譜峰；匹配程序用JAVA程序和MySQL數(shù)據(jù)庫編寫；最后通過Biolynx軟件計算驗證。

2 結(jié)果與討論

2.1 超高效液相色譜-質(zhì)譜分析

本實驗對發(fā)酵乳粗分離物經(jīng)消化處理后進行了超高效液相色譜-質(zhì)譜分析。圖1為消化處理后產(chǎn)物的液相色譜圖，根據(jù)本實驗的處理方法，共得到1025種低分子量化合物，證實了經(jīng)瑞士乳桿菌發(fā)酵得到的發(fā)酵產(chǎn)物中物質(zhì)的復(fù)雜性以及質(zhì)譜檢測器優(yōu)越的靈敏度和分離性。

Pradeep B.Kunda等人[7]研究了一種商業(yè)化的抗高血壓功能性酸奶，該酸奶由多種特殊菌種作為發(fā)酵劑發(fā)酵而成，樣品經(jīng)C18和STX兩種萃取小柱前處理后，用μLC-TOF-MS檢測，分別得到1544和1676種低分子量化合物。Sergio Català-Clariana等人[8]用CE-MS檢測嬰兒配方奶粉中的生物活性物質(zhì)，用三種不同的萃取小柱前處理以期得到數(shù)量最全的低分子物質(zhì)，最終鑒定得到91種低分子物質(zhì)。因為以前這些研究多采用多種發(fā)酵菌種的混合發(fā)酵，因此得到的低分子量產(chǎn)物比較多。而本實驗采用單一的瑞士乳桿菌發(fā)酵，然后在模擬人體內(nèi)的消化條件、經(jīng)過完全消化處理，所以得到的低分子量產(chǎn)物比相對少一些?？紤]到任何發(fā)酵產(chǎn)物中的生物活性物質(zhì)和非生物活性物質(zhì)均有可能在動物體內(nèi)被進一步消化后吸收利用。所以本實驗對發(fā)酵產(chǎn)物在分析前模擬人體內(nèi)消化條件進行了完全消化預(yù)處理。對于生物活性物質(zhì)如果在動物體內(nèi)被消化，可能喪失其生物活性；也可能是體外測定得到的生物活性物質(zhì)在人體內(nèi)被消化降解為更小分子量的生物活性物質(zhì)，被消化吸收后發(fā)揮其生物活性，也就是體外得到的生物活性物質(zhì)存在核心片段，在動物體內(nèi)經(jīng)過消化釋放出來，被吸收后發(fā)揮其生物活性。

本實驗在UPLC-MS分析前，對發(fā)酵乳粗提物進行胃腸道消化模擬實驗，因此最終得到的多肽序列對消化酶有良好的耐受性，在一定程度上能抵抗其水解作用，才有可能被吸收利用發(fā)揮其生物活性作用。Zhou J等人[9]研究發(fā)現(xiàn)，生物活性多肽QEPVL在經(jīng)過消化處理后，大部分被消化成QEPV，并且其消化產(chǎn)物QEPV仍具有幾乎完全相同的生物活性。María del Mar Contreras等人[10]對酪蛋白來源的六種多肽進行了模擬胃腸道消化實驗，包括三種抗高血壓肽，結(jié)果六種多肽均有不同程度的水解，活性也發(fā)生了不同的變化。如RYLGY依然保持著較高的ACE抑制活性，而FVAPFPEV的ACE抑制活性卻有了很大程度的降低。不管多肽在實驗前后的序列、活性如何發(fā)生變化，對人體而言，只有經(jīng)過胃腸道的消化分解才有可能被人體消化吸收，從而發(fā)揮其活性。因此，本方法最終得到的多肽序列，在一定程度上能抵制消化酶的水解，有進入機體發(fā)揮其生物活性作用的可能性。

2.2 氨基酸序列質(zhì)量的匹對

以α s1-酪蛋白（ID：1087，變體B）為例，通過程序匹對，得到來源于該蛋白質(zhì)序列的可能多肽序列共55條，具體序列如表1所示。

2.3 多肽序列的驗證

本方法將預(yù)測得到的可能多肽序列經(jīng)Biolynx驗證，最終得到牛乳蛋白來源多肽共118條。其中，α s1-酪蛋白、α s2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白、血清白蛋白來源的多肽序列分別為8，5，21，7，5，11，44，17條，具體分布見表2。由表2可知，得到的多肽大多為3～6個氨基酸組成。經(jīng)胃消化模擬模擬實驗后鑒定得到的多肽序列，多為低分子量的小肽，具有易被吸收的特點。Sadat-Mekmene L等人[11]研究發(fā)現(xiàn)，細胞膜上有可運輸寡肽的轉(zhuǎn)運體，主要運輸3～6個氨基酸殘基的多肽，使多肽進入細胞質(zhì)發(fā)揮其活性作用，同時需要ATP水解為肽轉(zhuǎn)運提供能量。

以α s1-酪蛋白（ID：1087，變體B）為例，根據(jù)本文方法對預(yù)測得到序列逐一分析，得到α s1-酪蛋白來源的多肽序列共8條，具體如表3所示。如質(zhì)核比為615.37 u的物質(zhì)，出峰時間為6.63 min，程序推測序列為LEQLL，提取質(zhì)荷比為615.37 u的質(zhì)量色譜圖及其一級質(zhì)譜圖，如圖2所示，將其質(zhì)譜圖導(dǎo)入Biolynx，由圖3、4可知，根據(jù)az，by斷裂的情況，發(fā)現(xiàn)該有6個碎片離子峰與LEQLL的實際二級質(zhì)譜圖相吻合，經(jīng)過Biolynx軟件分析計算，質(zhì)荷比615.37 u的序列片段證實為LEQLL，與α s1-酪蛋白的95-99殘基序列對應(yīng)。再如，質(zhì)荷比為544.38 u的序列物質(zhì)，程序推測序列為RLKK，提取質(zhì)荷比為544.38 u的質(zhì)量色譜圖及其一級質(zhì)譜圖，如圖5所示。同理，根據(jù)az，by斷裂的情況以及圖6、圖7，未發(fā)現(xiàn)與RLKK實際斷裂相吻合的碎片離子峰，經(jīng)過Biolynx軟件分析計算，可證實質(zhì)荷比544.38 u的序列片段不是RLKK。

表1 預(yù)測得到來源于αs1-酪蛋白（ID：1087，變體B）的可能多肽序列

表2 瑞士乳桿菌發(fā)酵乳粗分離物經(jīng)消化處理后的產(chǎn)物中多肽的分布

表3 αs1-酪蛋白來源多肽的鑒定

其中，實驗中證實已被發(fā)現(xiàn)的生物活性多肽GS和SG，它們都具有較高的抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性[12]，文中測定GS和SG的IC50分別為3800和8 500 μmol/L。Jose Angel Gomez-Ruiz等人[18]研究了多種西班牙奶酪，具體篩選了分子量＜1 000 u的混合物，并用HPLC-MS/MS和離線MS/MS具體分析其中成分，從一種Cabrales奶酪中分離得到了多肽MPL，并研究了其抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性，發(fā)現(xiàn)活性不顯著。此外，鑒定得到的其它αs1-酪蛋白來源多肽序列也分別有被報道過。

除αs1-酪蛋白來源外，還有大量經(jīng)驗證具有生物活性的、其他乳蛋白來源的生物活性多肽，如具有ACE抑制活性的FPIIV[20]，來源于β-酪蛋白的第205～209位殘基；具有抗菌活性的KKISQ[21]，來源于αs2-酪蛋白的第180～184位殘基等。此外，通過本研究建立的方法，還獲得了一系列新的多肽序列，關(guān)于這些新多肽序列的活性有待進一步深入研究。

圖2 質(zhì)荷比為615.37 u的質(zhì)量色譜圖及質(zhì)譜圖

圖3 質(zhì)荷比為615.37 u的片段的二級質(zhì)譜匹對

圖4 質(zhì)荷比為615.37u的預(yù)測多肽az，by斷裂情況

圖5 質(zhì)荷比為544.38 u的質(zhì)量色譜圖及質(zhì)譜圖

圖6 質(zhì)荷比為615.37 u的片段的二級質(zhì)譜匹對

圖7 質(zhì)荷比為615.37 u的預(yù)測多肽az，by斷裂情況

3 結(jié)束語

本文對發(fā)酵乳進行了有效的前處理后，進行胃腸道消化模擬實驗，保證盡可能多的得到消化產(chǎn)物中的多肽，特別是濃度低的多肽，并且得到的多肽序列一定程度上具有抵抗水解的作用，更利于人體吸收并發(fā)揮其生物活性。同時，還建立了一種通過分子量匹配得到預(yù)測序列，通過Biolynx軟件計算驗證預(yù)測多肽序列的方法。通過這種方法鑒定得到牛奶蛋白來源多肽共118條，除大量已經(jīng)被報道過的生物活性肽外，還得到了一些未被前人報道過的多肽，為后續(xù)將研究這些新發(fā)現(xiàn)的多肽是否具有生物活性及其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。同時為研究探索其他來源的生物活性物質(zhì)提供了有效的方法。

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