張秀云，馮艷萍，熊東，葉文靜，朱粒仁，范阿強，陳建業(yè)，宋永硯

小干擾RNA沉默脂肪酸合酶基因對人肝細胞株HepG2脂代謝的影響

張秀云，馮艷萍，熊東，葉文靜，朱粒仁，范阿強，陳建業(yè)，宋永硯

目的：研究基因干擾技術沉默脂肪酸合酶（FAS）基因后對人肝細胞株HepG2細胞內(nèi)外脂質含量及脂代謝相關基因表達的影響。

方法：合成3對針對FAS mRNA不同位點序列的小干擾RNA（siRNA），分別轉染至人肝細胞株HepG2，實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測空白對照組（HepG2細胞不經(jīng)過任何處理）、陰性對照組（轉染沒有任何基因干擾作用的陰性siRNA）、FAS-siRNA-1轉染組、FAS-siRNA-2轉染組和FAS-siRNA-3轉染組的FAS mRNA的表達。蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測蛋白質的表達水平，篩選出沉默效果最佳的一對siRNA。將最有效siRNA轉染至HepG2細胞，48 h后測定細胞內(nèi)外甘油三酯及總膽固醇含量以及脂代謝相關基因的mRNA表達水平。

結果：25 nmol/L siRNA和3 μl/孔（24孔板）轉染試劑的轉染效率最高。FAS-siRNA-3對HepG2的FAS基因的沉默效果最好，F(xiàn)AS-siRNA-3轉染組的FAS在mRNA水平和蛋白水平分別降低為空白對照組的（52.33±3.07）%和（51.57±3.14）%。FAS-siRNA-3沉默F(xiàn)AS基因后HepG2的細胞內(nèi)和細胞外培養(yǎng)液中甘油三酯含量顯著低于空白對照組，細胞外總膽固醇含量顯著低于空白對照組。與空白對照組比較，F(xiàn)AS-siRNA-3轉染組HepG2的肝脂酶基因mRNA表達水平顯著升高（P＜0.0001），微粒體甘油三酯轉運蛋白基因mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。

結論：FAS基因沉默可顯著降低HepG2細胞內(nèi)甘油三酯、細胞外培養(yǎng)液甘油三酯和總膽固醇的含量，需進一步的體內(nèi)外實驗加以驗證。

小干擾RNA ； 脂肪酸合酶 ；人肝細胞株HepG2

Methods: A total of 3 pairs of small interfering RNA （siRNA） targeting different sequences of FAS mRNA were synthesized as FAS-siRNA-1, FAS-siRNA-2 and FAS-siRNA-3, meanwhile, 2 controls were established as Blank control group, in which HepG2 cells were not treated, and Negative control group, in which HepG2 cells were transfected by noneffective siRNA. The mRNA, and protein expression levels of FAS in HepG2 cells were examined by real-time fluorescence quantitative RCR and Western blot analysis to screen the most effective pair of siRNA for FAS gene silencing; and that specific siRNA was transtected to HepG2 cells for 48 hours to detect the intra-/extra-cellular TG, TC levels and the mRNA expression related to lipid metabolism in HepG2 cells.

Results: The screening experiment indicated that FAS-siRNA-3 was most effective for FAS gene silencing. Compared with Blank control group, the mRNA and protein expressions in FAS-siRNA-3 transfected HepG2 cells （Transfected group）

decreased to （52.33 ± 3.07） % and （51.57 ± 3.14） % respectively. Compared with Blank control group, Transfected group had the reduced intra-/extra-cellular TG levels and reduced extracellular TC level; while increased mRNA expression of hepatic lipase, P＜0.0001 and decreased mRNA expression of TG transfer protein in HepG2 microsome, P＜0.05.

Conclusion: FAS gene silencing could significantly decrease the intra-/extra- cellular TG level and extracellular TC level in HepG2 cells, those findings need to be confirmed by further in vivo and in vitro studies.

（Chinese Circulation Journal, 2015,30:670.）

高甘油三酯血癥（HTG）是動脈粥樣硬化的獨立危險因子，與心血管?。–VD）直接相關[1-6]。血漿甘油三酯主要來源于肝臟的從頭合成（de novo synthesis）。在肝甘油三酯從頭合成過程中，脂肪酸合酶（FAS）是起關鍵作用的多功能酶，其表達水平及活性決定了甘油三酯的合成速率以及血漿甘油三酯的水平[7]。重酒石酸煙堿誘導使大鼠肝FAS表達增強后，肝臟及血漿中甘油三酯水平顯著升高[8]。FAS抑制劑可以有效降低大鼠血漿甘油三酯水平以及逆轉非酒精性脂肪肝病[9,10]。本研究運用RNA干擾技術，特異性沉默HepG2細胞FAS表達，在細胞及分子水平上觀察FAS沉默后肝細胞內(nèi)外脂質含量以及脂代謝相關基因表達的改變，為相關體內(nèi)研究的開展提供實驗基礎。

1 材料與方法

主要實驗材料：試驗時間：2014-07至2014-10，本研究涉及主要儀器和試劑包括：人肝細胞株HepG2從武漢博士德購買；細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國ABI 7900HT）；轉染試劑TransIT-siQUEST（美國Mirus）；細胞總RNA提取試劑盒（北京天根）；熒光定量試劑盒（日本TaKaRa）；細胞總蛋白提取及定量試劑盒（上海碧云天）；FAS兔抗人一抗（美國GeneTex）；蛋白免疫印跡（Western blot）試劑盒（上海碧云天）；無血清培養(yǎng)液Opti-MEM（美國Gibco）；細胞內(nèi)甘油三酯/總膽固醇測定試劑盒（北京普利萊）；血清甘油三酯/總膽固醇測定試劑盒（浙江東甌）。小干擾RNA（siRNA）由上海吉碼制藥技術有限公司設計合成，3對siRNA及陰性對照序列分別為：FAS-siRNA-1：（280）GGACCUGUCUAGGUUUGAUTT； FAS-siRNA-2：（3072）CCCAGGCUGAAGUUUACAATT； FAS-siRNA-3：（7377）GGUCCUUCUACUACAAGCUTT； 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。

細胞培養(yǎng)：HepG2細胞采用Iscove's改良的Eagle培養(yǎng)基（IMEM）培養(yǎng)，含10%胎牛血清、2 000 μmol/L L-谷氨酰胺及雙抗（100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素）。細胞置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長至對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

轉染條件的優(yōu)化：HepG2細胞接種于24孔板培養(yǎng)，細胞融合度長至50%～70%時進行轉染。將轉染試劑（1.5 μl/孔或3 μl/孔）和熒光標記的陰性對照組siRNA（25、50或75 nmol/L）與無血清培養(yǎng)液（Opti-MEM）混合、靜置形成轉染復合物。轉染復合物的配制過程為：吸取50μl Opti-MEM培養(yǎng)液，加入轉染試劑并輕輕混勻。然后加入陰性對照組儲存液，移液槍反復輕輕吹打混勻。室溫下靜置20 min形成轉染復合物。將轉染復合物“十”字形滴加到細胞培養(yǎng)孔中，輕輕晃動培養(yǎng)板使之混合均勻，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后熒光顯微鏡拍照計數(shù)。根據(jù)熒光細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例確定最佳轉染條件。

最有效siRNA的篩選：以轉染條件優(yōu)化中得出的最佳轉染條件將陰性對照組及3對siRNA分別轉染進入HepG2細胞。轉染后48 h，實時熒光定量PCR分別檢測空白對照組（HepG2細胞不經(jīng)過任何處理）、陰性對照組（轉染沒有任何基因干擾作用的陰性siRNA）、FAS-siRNA-1轉染組、FAS-siRNA-2轉染組和FAS-siRNA-3轉染組的FAS mRNA的表達。FAS上游引物為5’-AAGGGCCTAGAGGAGCGTGT-3’，下游引物為5’-TGGTACTTGGCCTTGGGTGT’，產(chǎn)物大小為149bp；內(nèi)參照GAPDH上游引物為5’-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3’，下游引物為5’- GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3’，產(chǎn)物大小為132bp。定量反應體系：上、下游引物各0.5 μl，cDNA 1.0 μl，SYBR Premix Ex Taq 10 μl，dH2O 8.0 μl，總體積20 μl。反應條件：95℃預變性15s，95℃ 5s，60℃ 30s，45次循環(huán)。溶解曲線95℃ 5s，55℃ 60s，55℃～95℃30s。根據(jù)2-ΔΔCt法計算樣本的mRNA含量。

Western blot法檢測細胞中FAS的表達量：嚴格按照試劑盒說明書提取細胞總蛋白并進行定量，蛋白變性后行十二烷基磺酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜、封閉后，各組先后與兔抗人FAS一抗以及辣根過氧化物酶HRP標記的二抗孵育，洗膜后化學發(fā)光法成像。采用Image lab 3.0分析軟件對條帶灰度值進行測定并分析。

FAS-siRNA-3處理對HepG2細胞內(nèi)外脂質含量的影響：以最佳轉染條件和最有效siRNA（FAS-siRNA-3）轉染HepG2細胞。轉染后48 h，同時收集細胞和上清液。細胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇含量測定參照北京普利萊基因技術有限公司測定試劑盒說明書進行：細胞加入裂解液充分吹打裂解，12 000×g、4℃離心10 min。取上清，分成兩份，一份真空冷凍抽干后采用細胞甘油三酯和總膽固醇測定試劑盒測定甘油三酯和總膽固醇含量；另一份采用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白質濃度（參照上海碧云天生物技術有限公司的蛋白質濃度測定試劑盒說明書進行），結果以每g蛋白質對應的細胞內(nèi)甘油三酯或總膽固醇含量（mmol/g）表示。細胞培養(yǎng)上清液甘油三酯和總膽固醇含量測定：取1 ml上清液真空冷凍抽干，采用血清甘油三酯和總膽固醇測定試劑盒測定490 nm處的吸光度，根據(jù)標準液的吸光度值求出樣品溶液的甘油三酯及總膽固醇含量。每個處理重復3次，均值用于統(tǒng)計分析。

FAS-siRNA-3處理對HepG2細胞脂代謝相關基因表達的影響：以最佳轉染條件和最有效siRNA（FAS-siRNA-3）轉染HepG2細胞。轉染后48 h，裂解細胞提取總RNA，實時熒光定量PCR檢測肝脂酶基因（HL）、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因（HMGR）、固醇調節(jié)元件結合蛋白-1基因（SREBP1）、微粒體甘油三酯轉運蛋白基因（MTP）、載脂蛋白B100基因（APOB100）的mRNA表達水平。每個處理重復3次，均值用于統(tǒng)計分析。

2 結果

轉染條件的優(yōu)化（圖1）：轉染后6 h，根據(jù)熒光細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例計算，1.5 μl/孔（24孔板）轉染試劑×25 nmol/L siRNA、1.5 μl/孔轉染試劑×50 nmol/L siRNA、1.5μl /孔轉染試劑×75 nmol/L siRNA、3 μl/孔轉染試劑×25nmol/L siRNA、3 μl/孔轉染試劑×50 nmol/L siRNA和3 μl/孔轉染試劑×75 nmol/L siRNA的轉染率分別為43.0%、35.5%、49.0%、65.0%、32.5.0%和50.0%，因此確定3 μl/孔轉染試劑×25 nmol/L siRNA的轉染效率最高。

圖1 25 nmol/L熒光標記的小干擾RNA轉染HepG2細胞6 h后的熒光照片（×200）

最有效siRNA的篩選：實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)FAS-siRNA-1和FAS-siRNA-3對FAS基因的沉默效果較好。與空白對照組（100±7.89）%比較，陰性對照組的FAS mRNA水平為（96.79±20.26）%。FAS-siRNA-1轉染組、FAS-siRNA-2轉染組和FAS-siRNA-3轉染組的mRNA水平分別降低為空白對照組的（52.57±2.36）%、（61.42±5.23）%和（52.33±3.07）%，與空白對照組和陰性對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001）。通過Western blot法檢測細胞內(nèi)FAS的表達量，與空白對照組比較，F(xiàn)AS-siRNA-1轉染組、FAS-siRNA-2轉染組和FAS-siRNA-3轉染組的FAS含量分別降低為空白對照組的（64.34±7.85）%、（69.74±11.61）%和（51.57±3.14）%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。根據(jù)實時熒光定量PCR和Western blot檢測結果確定FAS-siRNA-3對FAS基因沉默效果最好，為最佳干擾siRNA，用于后續(xù)實驗。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測不同處理下脂肪酸合酶的蛋白質表達水平

FAS-siRNA-3處理對HepG2 48 h后細胞內(nèi)外脂質含量的影響（表1）： FAS-siRNA-3轉染組細胞內(nèi)甘油三酯含量顯著低于空白及陰性對照組（P＜0.05），細胞外培養(yǎng)液中甘油三酯和總膽固醇含量顯著低于空白及陰性對照組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。細胞內(nèi)總膽固醇含量在各組之間差異無統(tǒng)計學意義。

表1 FAS-siRNA-3處理HepG2細胞48h后細胞內(nèi)外甘油三酯和總膽固醇的相對百分含量

表1 FAS-siRNA-3處理HepG2細胞48h后細胞內(nèi)外甘油三酯和總膽固醇的相對百分含量

注：FAS：脂肪酸合酶；siRNA：小干擾RNA。與空白對照組和陰性對照組相比*P＜0.05

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FAS-siRNA-3處理對HepG2細胞脂代謝相關基因表達的影響（表2）：與空白及陰性對照組比較，F(xiàn)AS-siRNA-3轉染組HL基因表達顯著增強（P＜0.0001），MTP基因表達水平顯著降低（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。HMGR、SREBP1和APOB1000的表達水平在各組之間差異無統(tǒng)計學意義。

表2 FAS-siRNA-3處理HepG2細胞48 h后脂代謝相關基因mRNA的相對百分含量

表2 FAS-siRNA-3處理HepG2細胞48 h后脂代謝相關基因mRNA的相對百分含量

注：HL：肝脂酶基因；HMGR：3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因；SREBP1：固醇調節(jié)元件結合蛋白-1基因；MTP：微粒體甘油三酯轉運蛋白基因；APOB100：載脂蛋白B100基因；與空白對照組和陰性對照組相比*P＜0.05**P＜0.0001。余注見表1

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3 討論

FAS是催化脂肪酸合成的關鍵酶, 已成為治療高脂血癥、肥胖、腫瘤等疾病的重要靶標[11,12]。在人類細胞中，F(xiàn)AS是含有兩個相同亞基的同源二聚體，兩亞基首尾相接，構成一個環(huán)狀的多酶復合體。FAS每個亞基大小約為270 kD，含有乙酰轉移酶等7種酶活性，依次以乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A為原料合成16碳的軟脂酸，軟脂酸進一步延長和酯化成甘油三酯。人FAS定位于染色體17q25，含有42個內(nèi)含子和43個外顯子，長約22 kb。FAS普遍表達于全身各組織中，在肝臟的表達量最高，其脂肪酸合成能力是脂肪組織的8～9倍[13]。

血液甘油三酯主要來源于肝臟的從頭合成。肝細胞合成的甘油三酯以極低密度脂蛋白（VLDL）的形式釋放入血。FAS在肝臟中的表達水平及活性與血漿甘油三酯水平顯著相關。Ma等[8]給雌性Wistar大鼠注射重酒石酸煙堿[1mg/（kg·d）]2周后，肝臟FAS表達顯著增強，同時肝臟及血漿中的甘油三酯水平顯著增高。與之對應，大豆異黃酮干預非酒精性脂肪肝模型大鼠12周后，肝FAS表達水平顯著降低，同時肝臟及血清中的甘油三酯顯著降低[14]。

基于FAS在高甘油三酯血癥發(fā)病中的重要作用，F(xiàn)AS很可能成為臨床治療高甘油三酯血癥的一個重要靶點，抑制FAS基因表達也很可能成為治療高甘油三酯血癥的重要手段。

RNA干擾技術根據(jù)靶基因mRNA序列設計互補的siRNA，體外合成后導入細胞或體內(nèi)，在細胞內(nèi)siRNA與一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結合形成RNA誘導的沉默復合物（RISC）。RISC識別和結合靶基因mRNA的同源區(qū)域，并在結合區(qū)內(nèi)切割mRNA，導致靶基因功能缺失，從而達到疾病治療的目的。RNA干擾技術已廣泛應用于高脂血癥相關基因的沉默[15-19]。本研究首次運用siRNA技術沉默F(xiàn)AS基因。研究結果顯示，siRNA有效抑制FAS基因表達后，細胞內(nèi)及細胞外培養(yǎng)液中甘油三酯含量較對照組顯著降低，提示通過siRNA沉默F(xiàn)AS基因可能是一條潛在的降低血漿甘油三酯水平的有效途徑。

肝細胞從頭合成甘油三酯后，通過合成和分泌VLDL將其轉出肝臟。MTP存在于肝細胞內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)，是VLDL組裝必需的異源二聚體酯轉運蛋白。MTP的主要功能是將新合成的甘油三酯轉運至載脂蛋白B，逐漸形成成熟的VLDL顆粒。VLDL顆粒不僅轉運內(nèi)源性甘油三酯，肝合成的膽固醇也通過其轉出。當VLDL-甘油三酯被脂蛋白酯酶（LPL）水解后，VLDL殘?？赊D變成低密度脂蛋白（LDL）。因此，MTP不僅在肝甘油三酯輸出中發(fā)揮作用，而且與肝膽固醇的分泌有關。研究顯示，MTP抑制劑可顯著降低血漿總膽固醇水平[20,21]。在本研究中，F(xiàn)AS基因siRNA沉默后，MTP基因表達顯著下調，同時細胞外總膽固醇含量顯著降低，這可能是因為FAS基因表達被抑制后，HepG2細胞分泌VLDL顆粒減少，從而導致膽固醇分泌也減少，培養(yǎng)液中總膽固醇降低。FAS基因沉默可能對MTP基因的表達形成正反饋，使MTP基因表達顯著降低。肝細胞內(nèi)甘油三酯

和膽固醇的合成是協(xié)調一致的，當肝甘油三酯合成受到抑制時，膽固醇的合成也會相應降低[22]，因此，盡管在本研究中HepG2細胞分泌的膽固醇減少，細胞內(nèi)膽固醇含量也沒有顯著增加。

HL存在于肝血竇內(nèi)皮細胞，其功能是水解VLDL殘粒中的甘油三酯，促進VLDL殘骸的清除。在本研究中，F(xiàn)AS基因沉默后HL基因表達顯著增高，這提示FAS基因沉默后不僅可以減少肝臟VLDL的合成與輸出，還可促進肝臟對外周脂蛋白殘骸的吸收和清除。本研究沒有發(fā)現(xiàn)siRNA沉默F(xiàn)AS基因后SREBP1基因表達發(fā)生顯著性變化，提示FAS基因沉默后MTP基因和HL基因表達的改變可能是通過其它信號通路實現(xiàn)的。

本研究在細胞水平上揭示了FAS基因siRNA沉默可降低肝細胞內(nèi)及細胞外培養(yǎng)液中的甘油三酯水平，也可降低細胞外培養(yǎng)液中的總膽固醇水平，需進一步的體內(nèi)外實驗加以驗證。

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Effect of Small Interfering RNA Silencing the Fatty Acid Synthase Gene on Lipid Metabolism in Human Hepatic Cell Line HepG2

ZHANG Xiu-yun, FENG Yan-ping, XIONG Dong, YE Wen-jing, ZHU Li-ren, FAN A-qiang, CHEN Jian-ye, SONG Yong-yan.
Department of Biochemistry, School of Preclinical Medicine, North Sichuan Medical College, Nanchong （637000）, Sichuan, China

Objective: To investigate the effect of the gene interfering technology on fatty acid synthase （FAS） gene silencing for lipid contents in human hepatic cell line HepG2 and to study the lipid metabolism related gene expression in HepG2 cells.

Small Interfering RNA; Fatty acid synthase; Human hepatic cell line HepG2

2014-11-24）

（編輯：汪碧蓉）

四川省應用基礎研究計劃（2013JY0072）；四川省教育廳重點項目（12ZA232）

637000 四川省南充市，川北醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生物化學教研室（張秀云、陳建業(yè)、宋永硯）；川北醫(yī)學院臨床醫(yī)學系（馮艷萍、熊東、葉文靜、朱粒仁、范阿強）

張秀云 講師 碩士 主要從事脂代謝紊亂與動脈粥樣硬化研究 Email: 396530604@qq.com 通訊作者：宋永硯 Email: songyongyan2014@hotmail.com

R54

A

1000-3614（ 2015 ）07-0670-05

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2015.07.014