響應面分析法優(yōu)化馬蘭總黃酮提取工藝研究

王諍，王國凱，劉勁松，蔡百祥，高衛(wèi)娜，王剛

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽 合肥230012)

[摘要]目的應用響應面分析法優(yōu)化馬蘭總黃酮的提取工藝。方法以單因素研究為基礎(chǔ)，以總黃酮提取量為響應值，以4因素3水平的響應面分析法優(yōu)化馬蘭總黃酮的提取工藝。結(jié)果馬蘭總黃酮的最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇濃度為40%，液料比為16.5∶1，提取時間為2 h，提取次數(shù)3次，在該條件下，馬蘭總黃酮提取量預測值為162.538 mg，實際驗證值為156.867 mg，并得出各因素對馬蘭總黃酮提取量的影響大小依次為乙醇濃度、液料比、提取次數(shù)、提取時間。結(jié)論響應面分析法可用于優(yōu)化馬蘭總黃酮的提取工藝，實驗驗證值與模型預測值基本相符。

[關(guān)鍵詞]馬蘭；總黃酮；提取工藝；響應面分析法

[中圖分類號]R284.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.05.026

基金項目：國家自然科學

作者簡介：王諍(1991-)，男，碩士研究生

收稿日期：(2015-01-27；編輯：姚實林)

馬蘭，別名魚鰍串、田邊菊，菊科，多年生草本。馬蘭載于《本草拾遺》，全草藥用，有清熱解毒、消食積、利小便、散瘀止血之效[1]。全國各地均有分布，具有極其豐富的野生資源。民間常作為保肝明目的保健食品大量食用[2]。

近年來對馬蘭總黃酮的研究較多，優(yōu)化總黃酮最佳提取工藝不僅能更有效地利用資源，也為進一步深入研究馬蘭提供依據(jù)。響應面分析法能夠以最小的成本對多變量系統(tǒng)進行極其有效的優(yōu)化，并能準確分析各因素對響應值的影響以及各因素間的交互作用對響應值的影響。通過傳統(tǒng)正交方法只能得出最佳的因素水平組合，不能得出整體區(qū)域中各因素的最優(yōu)組合和最優(yōu)響應值，而響應面設(shè)計方法通過更多的水平實驗方案，擬合二階以上的模型，以找到設(shè)計的最優(yōu)點[3-4]。

通信作者：王國凱，wanggk7779@163.com

本研究以馬蘭總黃酮提取含量為響應值，應用響應面分析法優(yōu)化馬蘭總黃酮的提取條件，從而得出最優(yōu)的馬蘭總黃酮提取工藝，以期為今后的馬蘭相關(guān)研究提供參考。

1　儀器與材料

馬蘭：購自安徽省亳州市藥材市場，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學中藥標本中心黃和平副教授鑒定為菊科植物馬蘭Kalimerisindica(L.) Sch-Bip的干燥全草；蘆丁對照品：購自中國藥品生物制品檢定研究院；實驗過程中所用化學試劑：純度均為分析純。UV759CRT紫外分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；十萬分之一電子天平：賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

Determination of Content of 6-Gingerol in Kean Cream by High-Performance Liquid Chromatography

ZHENGZhi-yun1,GUIShuang-ying1,LONGZi-jiang1,ZHOUXu-tian2

(1.AnhuiUniversityofChineseMedicine&AnhuiEngineeringResearchCenterforChineseMedicinePreparation&InstituteofPharmaceutics,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.AnqingAnticancer&AnalgesiaResearchInstitute,AnhuiAnqing246001,China)

Abstract[] ObjectiveTo establish a method for determination of the content of 6-gingerol in Kean Cream by high-performance liquid chromatography (HPLC). MethodsThe C18 chromatographic column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) was used with a mobile phase of methanol-water (70∶30). The detection wavelength was 280 nm; the flow rate was 1.0 mL/min; the column temperature was 30 ℃; the sample size was 20 μL. ResultsA good linear relationship was achieved when the concentration of 6-gingerol ranged between 1.02 and 20.4 μg/mL (r=0.999 9). The average recovery rate was 98.83%, and the relative standard deviation was 1.08% (n=6).ConclusionThe HPLC-based method is simple, precise, and reliable for determination of content of 6-gingerol in Kean Cream.

[Key words]high-performance liquid chromatography; 6-Gingerol; Kean Cream; content determination

2　方法與結(jié)果

2.1線性關(guān)系考察準確稱取干燥后的蘆丁對照品8.6 mg，以濃度為75%的乙醇于25 mL容量瓶中定容至刻度，充分溶解后搖勻，得對照品溶液(0.344 mg/mL)。分別量取0.25、0.5、0.75、1.00、1.25 mL置于5個5 mL容量瓶中，再分別加入0.2 mL濃度為5%的NaNO2溶液，搖勻，靜置5 min后，再加入0.2 mL濃度為10%的Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min后，加入2 mL濃度為4%的NaOH溶液，然后，以75%的乙醇定容，搖勻后靜置15 min，以樣品空白溶劑為參比液，在波長506 nm處測得其吸光度[5-6]。繪制以所測得的吸光度值為縱坐標，以稀釋后對照品溶液的濃度為橫坐標的標準曲線，得到以濃度為自變量、吸光度為因變量的標準曲線回歸方程：y=0.112 5x+0.008 1，r=0.999 5。結(jié)果顯示，對照品溶液濃度在8.72～52.32 μg/mL時與吸光度有較好的線性關(guān)系。

2.2馬蘭總黃酮的提取工藝取干燥藥材粉末50 g，用乙醇回流提取，濾過，合并濾液，減壓濃縮，干燥，得干浸膏，取樣定容，按“2.1”項下方法測得吸光度。

2.3單因素試驗根據(jù)相關(guān)文獻，通過控制變量的方法分別考察乙醇濃度、液料比、提取時間、提取次數(shù)4個因素對馬蘭中總黃酮提取量的影響，試驗結(jié)果見圖1。由結(jié)果可知，綜合考慮，4個因素的最優(yōu)值分別確定為：乙醇濃度為50%，液料比為15∶1，提取3次，每次提取1.5 h。

圖1 乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)對馬蘭總黃酮提取含量(50 g馬蘭中提取量)的影響

參考文獻2.4Box-Behnken試驗設(shè)計以單因素試驗及相關(guān)為依據(jù)來設(shè)定Box-Behnken實驗設(shè)計中各因素的水平，以馬蘭總黃酮提取量為響應值，對影響馬蘭總黃酮提取量的乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)進行優(yōu)化，響應面試驗設(shè)計因子水平見表1。使用Design Expert 8.05b對數(shù)據(jù)進行處理及分析。

表1　響應面試驗設(shè)計因子水平表

2.5響應面實驗結(jié)果根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理及單因素試驗所得結(jié)果，選擇“2.4”項4個影響因素，并以單因素試驗結(jié)果為中心水平，進行4因素3水平的響應面優(yōu)化實驗，確定最佳提取條件。實驗結(jié)果見表2。

使用Design Expert 8.05b 統(tǒng)計軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到總黃酮提取量對A、B、C、D四因素的二次多項回歸方程：總黃酮提取量=145.74-10.15A-8.43B-1.95C+ 4.41D-9.39AB-16.73AC+9.33AD-1.16BC+2.33BD+8.21CD-3.35A2-0.82B2-5.37C2-5.57D2。

對上述模型進行方差分析(見表3)發(fā)現(xiàn)，一次項中乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取次數(shù)(D)，二次項中提取時間(C2)、提取次數(shù)(D2)，交互項中乙醇濃度和提取時間(AC)、乙醇濃度和提取次數(shù)(AD)、提取時間和提取次數(shù)(CD)對總黃酮提取量的影響均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明各因素對總黃酮提取量的影響不是簡單的線性關(guān)系?；貧w方程的顯著性檢測結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1)，回歸方程的失擬(lack of fit)檢驗結(jié)果不具有統(tǒng)計學意義(P=0.696 1)；回歸方程的擬合優(yōu)度很高(R2=0.948 5，校正R2=0.897，CV=3.11%)，說明上述方程能較好地反映A、B、C、D四個因素與馬蘭總黃酮提取量的關(guān)系。

圖2顯示，總黃酮提取量隨著提取時間和提取次數(shù)的增加呈不斷上升趨勢，由其等高線圖可看出，等高線在提取時間軸方向分布較為密集，說明提取時間對總黃酮提取量的影響較提取次數(shù)的影響大，另外，等高線呈現(xiàn)出較規(guī)則的橢圓形，說明C、D因素之間存在較為顯著的交互效應[7]。由圖3可知，黃酮含量隨液料比和提取次數(shù)的增大而不斷增大，由等高線圖可知，液料比對總黃酮提取量的影響比提取次數(shù)大。同理，由圖4、圖5、圖6、圖7可得出，液料比對總黃酮提取量的影響大于提取時間的影響，乙醇濃度對總黃酮提取量的影響大于提取次數(shù)，乙醇濃度和提取時間二者對總黃酮提取量的交互作用很強，且乙醇濃度的影響大于提取時間，乙醇濃度與液料比之間也有較好的交互作用。因此，可以得出各因素對總黃酮提取量的影響程度依次為：A>B>D>C。

表2　響應面實驗設(shè)計方案及結(jié)果

表3　回歸模型方差分析

使用Design Expert 8.05b對回歸方程進行求解，得出預測最優(yōu)提取工藝為：乙醇濃度為40%，液料比為16.46∶1，提取時間2.00 h，提取次數(shù)為3.39，總黃酮含量的預測值為162.538 mg(50 g生藥)。綜合考慮將工藝調(diào)整為：乙醇濃度為40%，液料比為16.5∶1，提取2 h，提取3次。

按照上述所得工藝，平行提取3份，測定實際平均總黃酮提取量為156.86 mg(50 g生藥)，與預測值之間偏差較小，表明此回歸模型能與實際情況較好擬合，從而也更加證明此模型的可行性。

4　討論

響應面分析法是一種更為合理有效的試驗設(shè)計方法，它通過利用合理的試驗設(shè)計方法并通過試驗得到數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因子和響應值之間的函數(shù)關(guān)系，指導多變量優(yōu)化問題[8]。以最經(jīng)濟、簡便的方式優(yōu)化得出最優(yōu)工藝，與正交試驗設(shè)計法不同，它不僅能夠克服正交設(shè)計無法從整體區(qū)域找出因素的最優(yōu)組合和響應值的缺陷，還能夠得出精度較高的回歸方程，并且具有能夠分析各因素間交互效應的優(yōu)點。

本研究以單因素研究為基礎(chǔ)，以響應面分析法對馬蘭總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，得出了最優(yōu)的工藝條件，并且驗證實驗結(jié)果與預測值相近，可見實驗設(shè)計及結(jié)果分析都比較準確可靠，綜上所述，響應面分析法是優(yōu)化馬蘭總黃酮提取工藝的有效方法。

圖2　提取時間和提取次數(shù)對馬蘭總黃酮提取量影響的效應面圖和等高線圖

圖3　液料比和提取次數(shù)對馬蘭總黃酮提取量影響的效應面圖和等高線圖

圖4　液料比和提取時間對馬蘭總黃酮提取量影響的效應面圖和等高線圖

圖5　乙醇濃度和提取次數(shù)對馬蘭總黃酮提取量影響的效應面圖和等高線圖

圖6　乙醇濃度和提取時間對馬蘭總黃酮提取量影響的效應面圖和等高線圖

圖7乙醇濃度和液料比對馬蘭總黃酮提取量影響的效應面圖和等高線圖

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Optimization of Extraction Technique for Total Flavonoids inKalimerisindica(L.) Sch-Bip by Response Surface Analysis

WANGZheng,WANGGuo-kai,LIUJin-song,CAIBai-xiang,GAOWei-na,WANGGang

(SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine&AnhuiKeyLaboratoryofModernChineseMateriaMedica,AnhuiHefei230012,China)

Abstract[] ObjectiveTo optimize the extraction technique for total flavonoids in Kalimeris indica (L.) Sch-Bip by response surface analysis. MethodsBased on the single-factor experiment and with the yield of total flavonoids as the response, a four-factor, three-level response surface analysis was used to optimize the extraction technique for total flavonoids in Kalimeris indica (L.) Sch-Bip. ResultsThe results indicated that in the optimal extraction technique, raw material was treated with 40% ethanol (16.5 times) three times (2 h each time). In this condition, the predicted and experimental yields of total flavonoids in Kalimeris indica (L.) Sch-Bip were 162.538 mg and 156.867 mg, respectively. The most important influencing factor for the yield of total flavonoids was ethanol concentration, followed by solid-liquid ratio, extraction times, and extraction duration. ConclusionResponse surface analysis can be used to optimize the extraction technique for total flavonoids in Kalimeris indica (L.) Sch-Bip. The experimental value almost accords with the predicted value.

[Key words]Kalimerisindica(L.) Sch-Bip; total flavonoids; extraction technique; response surface analysis