補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)小鼠蛻膜組織超微結(jié)構(gòu)的影響

李偉莉1，楊璇2，李肖鳳1

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥230038)

[摘要]目的觀察補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)小鼠蛻膜組織血管、細(xì)胞形態(tài)及血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。方法采用DBA/2×CBA小鼠，按照Clark經(jīng)典方法復(fù)制RSA小鼠模型。按妊娠順序?qū)⑿∈箅S機(jī)分為正常妊娠組，模型組，西藥組，補(bǔ)腎安胎沖劑高、中、低劑量組，每組10只，分別進(jìn)行藥物干預(yù)。光鏡下觀察蛻膜組織的血管和細(xì)胞形態(tài)，電鏡下觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果光鏡下見模型組血管數(shù)量減少，蛻膜細(xì)胞胞漿明顯水腫，部分核消失，細(xì)胞核固縮；補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組血管豐富且管壁完整，由多個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞而成，小部分蛻膜細(xì)胞水腫，細(xì)胞核基本無壞死；補(bǔ)腎安胎沖劑中、低劑量組血管數(shù)量少于補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列不整齊，部分蛻膜細(xì)胞胞漿水腫，空泡變，少數(shù)細(xì)胞核消失。電鏡下見模型組血管壁不完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞核呈梭形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體減少，部分線粒體已破壞；補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組血管壁完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核膜完整；胞漿中可見豐富粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體，線粒體結(jié)構(gòu)完整、無腫脹變性，染色質(zhì)分布均勻；補(bǔ)腎安胎沖劑中、低劑量組血管壁完整，部分血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，核膜完整，胞漿中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核糖體輕度減少，部分線粒體腫脹、空泡變。結(jié)論RSA模型小鼠存在母胎界面血管生成的障礙，補(bǔ)腎安胎沖劑可以修復(fù)RSA小鼠蛻膜組織中破壞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改善血管生成和細(xì)胞器完整度，發(fā)揮安胎作用。

[關(guān)鍵詞]補(bǔ)腎安胎沖劑；復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)；蛻膜組織；超微結(jié)構(gòu)

[中圖分類號(hào)]R714.21[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.05.020

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)

作者簡介：李偉莉(1958-)，女，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師

收稿日期：(2015-01-29；編輯：曹健)

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn)[1]，發(fā)病率約占育齡夫婦的1%～5%[2]。引起RSA的原因復(fù)雜，除染色體、內(nèi)分泌、感染、免疫因素及內(nèi)生殖器官解剖異常外，仍有60%~70%的患者病因不明[3]。目前相關(guān)研究認(rèn)為，自然流產(chǎn)多繼之于胚胎停止發(fā)育或死胎，血管生成障礙在RSA中的作用越來越受到重視，胎盤健康的血管網(wǎng)絡(luò)對(duì)其正常的血液循環(huán)及胚胎發(fā)育相當(dāng)重要。本研究通過觀察RSA小鼠蛻膜組織形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)，探討補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)RSA小鼠母胎界面血管生成的作用。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用CBA/J小鼠(雌性60只，未產(chǎn)，鼠齡6～7周齡)、DBA/2小鼠(雄性25只，鼠齡6～7周齡)及BALB/c小鼠(雄性5只，鼠齡6～7周齡)，均由北京華阜康生物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0004。22～25 ℃下飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)開始前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2藥物及試劑補(bǔ)腎安胎沖劑(由菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、太子參、白術(shù)、白芍、黃芩、熟地黃、苧麻根、旱蓮草等組成，每袋10 g)，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，皖藥制字：BZ20080017；黃體酮(每粒50 mg，共20粒，批號(hào) 120638)：浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)；檸檬酸鉛(編號(hào) S178800)：北京達(dá)昱科儀公司；環(huán)氧丙烷(批號(hào) T20100610)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；醋酸雙氧鈾(編號(hào) 1180124)：美國SPI公司；無水乙醇(批號(hào) 131108)：江蘇省無錫市展望化工試劑公司；環(huán)氧樹脂：美國；中性樹膠：購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3主要儀器石蠟切片機(jī)(型號(hào)：2235)：德國萊卡；-80 ℃超低溫冰箱(型號(hào)：DW70-120)：日本Sanyo公司；自動(dòng)包埋機(jī)(型號(hào)：TB-718)：德國萊卡；病理切片機(jī)(型號(hào)：RM2135)：德國萊卡；恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)(型號(hào)：TK-218)：德國萊卡；超薄切片機(jī)(型號(hào)：LKB-NOVA)：瑞典；臺(tái)式電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：HH.B11.260-TBS)：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；透射電鏡(型號(hào)：JEM-1230)：日本；顯微圖像分析系統(tǒng)(BX51熒光顯微鏡，DP70數(shù)碼攝像裝置，JD形態(tài)分析系統(tǒng))：日本OLYMPUS。

2　方法

2.1動(dòng)物模型復(fù)制、分組與給藥采用具有隱性、反復(fù)性和父系特異性特征的DBA/2×CBA小鼠，按照Clark經(jīng)典方法復(fù)制RSA模型[4]。雌性CBA/J小鼠68只，雄性DBA/2小鼠27只，雄性BALB/c小鼠7只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，每晚將雌性CBA/J小鼠分別與雄性DBA/2及BALB/c小鼠按2∶1合籠交配，次日清晨觀察雌性小鼠陰道栓并進(jìn)行陰道涂片，以陰道涂片出現(xiàn)大量精子并出現(xiàn)陰道口大開及陰道栓作為妊娠第1天。分別復(fù)制RSA模型(CBA/J×DBA/2)50只和正常妊娠模型(CBA/J×BALB/c)10只。按妊娠順序隨機(jī)分為正常妊娠組，模型組，西藥(黃體酮26 mg/kg)組，補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量(35.1 g/kg)、中劑量(11.7 g/kg)、低劑量(3.9 g/kg)組，每組10只。

在妊娠第1天至第15天，每天上午每只小鼠按20 mL/kg灌胃。西藥組和補(bǔ)腎安胎沖劑各劑量組分別以相應(yīng)藥物灌胃，模型組和正常妊娠組灌服蒸餾水。

2.2標(biāo)本收集所有雌鼠于模型復(fù)制24 h后，即妊娠第16天，處死小鼠并完整分離蛻膜組織，用無菌生理鹽水洗凈血跡，取出標(biāo)本在4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定24 h，水洗，固定，脫水，包埋，切片厚度固定在4 μm，經(jīng)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后用BX51熒光顯微鏡觀察。取1 cm3組織若干塊，立刻固定到2.5%戊二醛溶液中6~12 h，放入磷酸鹽緩沖液中1~6 h，1%鋨酸溶液固定1~2 h，處理后包埋，切成厚70 nm的切片，電子染色(鉛、鈾染色)，JEM-1230型透射電鏡觀察，用數(shù)碼相機(jī)記錄圖像。

3　結(jié)果

3.1各組小鼠蛻膜組織血管形態(tài)比較正常妊娠組：蛻膜組織血管豐富，管壁完整，蛻膜細(xì)胞呈多邊形，相互嵌緊排列，胞質(zhì)豐富，染色淡，核呈卵圓形，位于中央，染色淡藍(lán)，核仁大而明顯(見圖1A)。模型組：光鏡下見血管數(shù)量明顯減少，大部分蛻膜細(xì)胞胞漿明顯水腫，部分核消失，細(xì)胞核固縮(見圖1B)。西藥組：血管較豐富、管壁完整，由多個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞而成，少數(shù)部分蛻膜細(xì)胞胞漿水腫，空泡變，少數(shù)細(xì)胞核消失(見圖1C)。補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組：血管豐富且管壁完整，由多個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞而成，小部分蛻膜細(xì)胞水腫，細(xì)胞核基本無壞死(見圖1D)。補(bǔ)腎安胎沖劑中劑量組：血管較多，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列不整齊，部分蛻膜細(xì)胞胞漿水腫，空泡變，少數(shù)細(xì)胞核消失(見圖1E)。補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組：血管數(shù)量減少，部分蛻膜細(xì)胞胞漿水腫，細(xì)胞空泡變，少數(shù)細(xì)胞核消失(見圖1F)。

注：A.正常妊娠組；B模型組；C.西藥組；D.補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組；E. 補(bǔ)腎安胎沖劑中劑量組；F. 補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組。

圖1各組小鼠蛻膜組織形態(tài)變化(HE染色，10×40倍)

3.2各組小鼠蛻膜組織血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較正常妊娠組：血管壁完整，由單個(gè)或多個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞而成，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜向腔面突起，核膜完整；胞漿中可見豐富粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體；線粒體無腫脹變性，嵴突完整；染色質(zhì)分布均勻(見圖2A)。模型組：血管壁不完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞核呈梭形，核內(nèi)染色質(zhì)邊聚；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞、減少；核糖體減少；大部分線粒體腫脹變性，呈空泡變化，部分線粒體已破壞(見圖2B)。西藥組：血管壁完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈長梭形，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核膜完整，細(xì)胞間隙稍增寬；胞漿中可見豐富粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體；線粒體腫脹變性，呈橢圓形；染色質(zhì)分布均勻(見圖2C)。補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組：血管壁完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈長梭形，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜向腔面突起，核膜完整；胞漿中可見豐富粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體；線粒體結(jié)構(gòu)完整，圓形或橢圓形，線粒體無腫脹變性；染色質(zhì)分布均勻；血管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞(見圖2D)。補(bǔ)腎安胎沖劑中劑量組：血管壁完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度腫脹，染色質(zhì)邊聚，核膜完整，細(xì)胞間隙增寬；胞漿中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；核糖體輕度減少；部分線粒體腫脹變性，呈空泡樣變化；血管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞(見圖2E)。補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組：血管壁完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹，核內(nèi)染色質(zhì)明顯邊聚，核膜完整；胞漿中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分?jǐn)U張；核糖體部分減少；部分線粒體腫脹，呈空泡樣變化(見圖2F)。

注：A.正常妊娠組；B模型組；C.西藥組；D. 補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組；E. 補(bǔ)腎安胎沖劑中劑量組；F.補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組。

圖2各組小鼠蛻膜組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的

超微結(jié)構(gòu)(×12 000倍)

4　討論

血管生成是體內(nèi)一種非常重要的過程，在包括再生、創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等在內(nèi)的許多生理和病理現(xiàn)象中都涉及到這一過程[5]。成功妊娠的維持需要依靠滋養(yǎng)細(xì)胞健康的生長，進(jìn)入母體子宮，侵入子宮螺旋小動(dòng)脈，取代血管內(nèi)皮、肌層，即完成血管重鑄，從而實(shí)現(xiàn)母兒之間的營養(yǎng)交換[6]。一旦母胎界面血管發(fā)生生成障礙，可能導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生。

補(bǔ)腎安胎沖劑以補(bǔ)腎健脾為治療RSA的基本大法，而此法具有防治流產(chǎn)的確切療效[7]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，胞脈為隸屬于胞宮的血脈，包括子宮內(nèi)膜的螺旋小動(dòng)脈等[8]，胚孕既成，沖任匯聚精血于胞脈以供養(yǎng)胚胎，與妊娠期母胎界面血管生成的作用有相似之處。中醫(yī)理論中雖然沒有直接提出血管生成的概念，但血管概念包括在“脈”“血脈”“絡(luò)脈”等含義中[9]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎藏精而主生殖，沖為血海，任主胞胎，沖任二脈根于腎，故曰“胞脈系于腎”，腎虛則沖任隨之失攝而滑胎。脾為后天之本，生血而統(tǒng)血，即可充養(yǎng)腎精，助腎之系胞脈功能之發(fā)揮，又能通過經(jīng)絡(luò)輸注營血于胞宮，濡養(yǎng)胞胎。前期研究顯示，補(bǔ)腎安胎沖劑能有效提高RSA小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2的表達(dá)，可能改善蛻膜血管的形成，促進(jìn)胚胎發(fā)育，從而降低流產(chǎn)率[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組較正常妊娠組血管數(shù)量明顯減少，血管完整度明顯降低，蛻膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞明顯，胞漿明顯水腫，部分細(xì)胞核消失；電鏡下見血管壁、血管內(nèi)皮細(xì)胞包膜結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞核呈梭形，核內(nèi)染色質(zhì)邊聚，細(xì)胞器明顯受損，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體破壞、減少，部分線粒體破壞。說明RSA存在母胎界面血管生成的障礙。補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組蛻膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整。補(bǔ)腎安胎沖劑中、低劑量組血管數(shù)量及管壁完整度較補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組稍低，但與模型組比較有明顯改善；電鏡下見補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組血管內(nèi)皮細(xì)胞包膜完整，核膜完整，細(xì)胞器完整。補(bǔ)腎安胎沖劑中、低劑量組血管管壁完整，核膜完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，胞漿中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分?jǐn)U張，部分核糖體減少，部分線粒體腫脹空泡變。由此可知，補(bǔ)腎安胎沖劑各劑量組小鼠蛻膜組織血管壁、血管內(nèi)皮細(xì)胞包膜、核膜的完整度，細(xì)胞器的數(shù)量及完整度明顯優(yōu)于模型組。提示補(bǔ)腎安胎沖劑可以修復(fù)RSA小鼠蛻膜組織中破壞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改善血管生成和細(xì)胞器完整度，促進(jìn)母胎界面的血管生成。

補(bǔ)腎安胎沖劑由菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、黃芪、白芍、黃芩等藥物組成。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪能明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、小管形成，具有顯著的促進(jìn)體外血管新生作用，其機(jī)制可能是通過增加血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的[11]。桑寄生葉提取物槲皮素能抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖及遷移[12]。白芍在免疫調(diào)節(jié)、抗炎和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞方面有很好的療效[13]。江雁等[14]研究表明，白芍可抑制縮宮素誘導(dǎo)的子宮平滑肌收縮。馬紅霞等[15]認(rèn)為，菟絲子總黃酮使流產(chǎn)大鼠的胎盤、蛻膜病理結(jié)構(gòu)發(fā)生良性逆轉(zhuǎn)，通過降低孕鼠的流產(chǎn)率來達(dá)到保胎目的，菟絲子總黃酮可能通過改變某種病理狀態(tài)，進(jìn)而改善血管的形成，延續(xù)妊娠過程。

本研究中RSA模型組血管生成異常，其蛻膜血管超微結(jié)構(gòu)改變，而補(bǔ)腎安胎沖劑各劑量組血管數(shù)量及管壁完整度，細(xì)胞器數(shù)量及其結(jié)構(gòu)完整度均較模型組明顯改善，說明中藥有改善母胎界面血管生成的作用。補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)RSA小鼠具有一定的防治作用，其機(jī)制可能與改善小鼠母胎界面血管生成有關(guān)。

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Effects of Granules for Tonifying the Kidney and Preventing Miscarriage on Ultrastructure of Decidual Tissue in Mice with Recurrent Spontaneous Abortion

LIWei-li1,YANGXuan2,LIXiao-feng1

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China; 2.GraduateDivision,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

Abstract[] ObjectiveTo investigate the effects of granules for tonifying the kidney and preventing miscarriage (GTKPM) on the blood vessels, cell morphology, and ultrastructure of vascular endothelial cells (VECs) of the decidual tissue in mice with recurrent spontaneous abortion (RSA). MethodsDBA/2×CBA mice were used to induce the mouse model of RSA by the classic Clark method. A total of 50 RSA model mice (CBA/J×DBA/2) were prepared, and 10 normal pregnancy mice (CBA/J×BALB/c) were prepared. The RSA model mice were randomly divided into model group, Western medicine group, high-dose GTKPM group, middle-dose GTKPM group, and low-dose GTKPM group (n=10 for each group). And they received respective interventions. The changes in blood vessels and cell morphology of decidual tissue were observed under a light microscope, and the changes in ultrastructure of VECs were observed under an electron microscope. ResultsUnder the light microscope, reduced number of blood vessels, obvious decidual cell cytoplasm edema, partial nuclear disappearance, and nuclear pyknosis in some decidual cells were observed in the model group; in the high-dose GTKPM group, the rich blood vessels were composed of many VECs and the vascular wall was integral, edema appeared in some decidual cells, and there were few necrotic nuclei; the middle- and low-dose GTKPM groups had few blood vessels than the high-dose GTKPM group, and in the two groups VECs were in disordered arrangement, edema and vacuolization of cytoplasm appeared in some decidual cells, and some nuclei disappeared. Under the electron microscope, in the model group, the vascular wall was incomplete, the structure of VECs was incomplete, nuclei were spindle-shaped, rough endoplasmic reticulums and ribosomes decreased, and some mitochondria were destroyed; in the high-dose GTKPM group, the vascular wall was integral, the structure of VECs andnuclearmembranewerecomplete,therewererichroughendoplasmicreticulumsandribosomes,the