黃愛博，洪文旭，葉金波，劉建軍，許 華*

（1. 暨 南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632；2. 深 圳市疾病預(yù)防控制中心，深圳市現(xiàn)代毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518055；3. 深 圳市人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所，廣東 深圳 518040）

三氯乙烯對L-02肝細(xì)胞中SET相互作用蛋白eEF1A1、eEF1A2和DDB1mRNA表達(dá)水平
的影響

黃愛博1，2，洪文旭3，葉金波2，劉建軍2，許 華1，*

（1. 暨 南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632；2. 深 圳市疾病預(yù)防控制中心，深圳市現(xiàn)代毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518055；3. 深 圳市人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所，廣東 深圳 518040）

三氯乙烯（trichloroethylene，TCE）是工業(yè)上廣泛應(yīng)用的一種有機(jī)溶劑，也是一種環(huán)境污染物，可通過呼吸道吸入和皮膚吸收進(jìn)入人體，主要蓄積于肝臟、腦、心臟等器官，對機(jī)體產(chǎn)生危害作用［1-2］。體內(nèi)外試驗(yàn)證明，TCE及其代謝產(chǎn)物可引起癌變、畸變及免疫毒性作用等，例如TCE對人類腎臟具有致癌作用，同時(shí)，TCE可引起人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變率的增高。國際癌癥研究署（International Agency for Research on Cancer，IARC）在1995年對TCE致癌性分類作了修改，將其對人類非致癌改為對人類可能致癌。2011年，美國環(huán)保局在針對TCE的最終健康評估報(bào)告中，將TCE歸類為人類致癌物。SET蛋白，最早因發(fā)現(xiàn)于患者SE的染色體畸變，被命名為SET蛋白（patient SE translocation，SET），已發(fā)現(xiàn)該蛋白與多種生物學(xué)活性相關(guān)，在基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生等方面的功能正越來越受到關(guān)注［3-4］。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)在L-02肝細(xì)胞中，SET蛋白的表達(dá)隨TCE濃度的升高而上調(diào)，并證明了SET蛋白在TCE肝細(xì)胞毒性作用中起到非常重要的角色。在后續(xù)的研究中，我們應(yīng)用串聯(lián)純化技術(shù)研究SET的相互作用蛋白，在SET復(fù)合物中鑒定出翻譯延長因子1A1（E longation factor 1-alpha 1，eEF1A1）、翻譯延長因子1A2（E longation factor 1-alpha 2，eEF1A2）及DNA損傷結(jié)合蛋白（damagespecific DNA binding protein 1，DDB1）。進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)TCE處理可以誘發(fā)這些SET的相互作用蛋白在蛋白表達(dá)水平、亞細(xì)胞定位及與SET的相互作用發(fā)生改變［5］。本研究用人肝細(xì)胞（L-02）為模型進(jìn)行體外研究，觀察TCE染毒對L-02肝細(xì)胞中的這些SET相互作用蛋白eEF1A1、eEF1A2和DDB1的mRNA表達(dá)水平的變化，為深入了解TCE致肝細(xì)胞毒性作用機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與試劑 人L-02肝細(xì)胞株，來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；1640培養(yǎng)基、EDTA-胰蛋白酶、雙抗（青霉素 鏈霉素）和胎牛血清（FBS）均購自美國Gibco公司；RNeasy Mini Kit購自德國Qiagen公司；SYBRPremix Ex TaqTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自日本TaKaRa公司；CCK-8購自日本Dojindo Molecular Technologies公司，三氯乙烯（ACS reagent，≥99.5%）、尿素（Urea）等其他試劑均購自美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器 FORMA 3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo Forma公司；GS-15R臺式冷凍離心機(jī)，美國Beckman公司；5417R型臺式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Mx4000型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國Shratagene公司；凝膠成像系統(tǒng)，英國UVI公司；Infinite M1000酶標(biāo)儀，美國TECAN Group Ltd公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn) L-02細(xì)胞接種于含10% 胎牛血清及100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RMPI-1640完全培養(yǎng)基上，置37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。采用活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測，接種細(xì)胞懸液100 μL于96孔板內(nèi)（每孔 8 000個(gè)細(xì)胞），預(yù)先置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時(shí)，按下列分組處理：①DMSO溶劑對照組為0.5% 二甲基亞砜（DMSO）+ddH2O+無血清培養(yǎng)基。②TCE染毒組（分別為1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L TCE）+0.5% DMSO +ddH2O+ 無血清培養(yǎng)基。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，24 h后，在每孔內(nèi)加入10 μL的CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在450nm波長處用Infinite M 1000酶標(biāo)儀檢測吸光度值D（450），細(xì)胞毒性檢測至少重復(fù)3次。

式中，D（450）染毒為具有細(xì)胞、CCK8溶液和TCE的孔的吸光度，D（450）空白為具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度，D（450）DMSO為 具有細(xì)胞、CCK8溶液和DMSO而沒有TCE的孔的吸光度。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用PICASSO（protein i nteraction confidence assessment system with multiple sources）（http://61.50.138.118/PICASSO/） 分析DDB1、eEF1A1及eEF1A2蛋白與SET蛋白的相關(guān)性［6］。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 將不同濃度的TCE（1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L）暴露處理L-02細(xì)胞，以DMSO為溶劑對照，每組設(shè)3個(gè)平行樣本。24 h后，對eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定。采用RNeasy Mini Kit試劑提取總RNA，用試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫eEF1A1、eEF1A2、DDB1和GAPDH基因序列，設(shè)計(jì)各mRNA引物，具體序列見表1。在對各目的基因進(jìn)行相對定量之前，先梯度稀釋cDNA模板進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線分析，以確定熒光定量PCR的最佳反應(yīng)條件及反應(yīng)體系，然后采用比較閾值法（threshold cycles，Ct），以看家基因GAPDH為內(nèi)參照，相對定量處理組樣品內(nèi)各目的基因的表達(dá)水平。反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μL，50×ROX Reference Dyell 0.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL， cDNA 2μL，ddH2O 8 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以熒光定量PCR儀所附帶的Mx 4000軟件自動計(jì)算并分析結(jié)果，熒光定量PCR 測 定至少重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SSPS 13.0軟件進(jìn)行對細(xì)胞毒性試驗(yàn)的吸光度相對值以及eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達(dá)的相對量進(jìn)行單因素方差分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 TCE對L-02細(xì)胞的毒性效應(yīng)

在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)染毒24 h后，TCE針對L-02肝細(xì)胞的IC50為16 mmol/L［7］。本研究選擇了IC50的1/2作為最高染毒濃度。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，與對照組比較，TCE染毒致使L-02細(xì)胞的活力顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。具體結(jié)果見圖1，所有的濃度均用于后續(xù)mRNA表達(dá)水平的分析中。

2.2 SET與eEF1A1、eEF1A2和DDB1蛋白的相關(guān)性判斷

PICASSO得分是評價(jià)兩個(gè)蛋白生物相關(guān)性的生物信息學(xué)指標(biāo)，如果PICASSO的得分超過2.0，認(rèn)為兩個(gè)蛋白具有相互作用。結(jié)果，eEF1A1、eEF1A2和DDB1蛋白與SET蛋白相關(guān)性的得分分別為4.6、4.6和8.8，認(rèn)為這3個(gè)蛋白與SET均具有相互作用。

2.3 TCE對L-02細(xì)胞內(nèi)eEF1A1、eEF1A2和DDB1mRNA表達(dá)水平的影響

2.3.1 RNA的純度、標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線分析 總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定，其D（260）/D（280）的比值在1.80～2.00之間，說明制備的RNA較純，無蛋白質(zhì)污染。瓊脂糖凝膠電泳顯示，28 S和18 S條帶清晰可見，并且28 S條帶亮度約為18 S的2倍，說明所提取的總RNA無明顯降解，完整性良好。

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分析可知，GAPDH、eEF1A1、eEF1A2和DDB1基因的擴(kuò)增效率均介于90%～110%之間，且相關(guān)系數(shù)均大于0.99，說明整個(gè)PCR擴(kuò)增系統(tǒng)工作良好，對目的基因的擴(kuò)增效率接近，可以開展后續(xù)的相對定量分析。根據(jù)熔解曲線分析結(jié)果（圖2）可知，GAPDH、eEF1A1、eEF1A2和DDB1基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線峰均為第一峰形，未見其他峰值，峰的形狀也較為銳利，提示各基因的熔解溫度均一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行定量是可靠的。

2.3.2 eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達(dá)水平的變化 不同濃度TCE（1.0、2.0、4.0和8.0 mmol/L）處理L-02細(xì)胞后，eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達(dá)水平的變化見圖3。結(jié)果可見，eEF1A1 mRNA表達(dá)水平在2.0 mmol/L以上TCE作用后顯著增加（P＜0.05），eEF1A2和DDB1 mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)隨著TCE濃度的增加先升高后降低的情況（P＜0.05或P＜0.01）。

3 討 論

SET是一種具有多種生物功能的重要的細(xì)胞因子，又名模板活化因子1（template activating factor 1，TAF1），參與基因表達(dá)調(diào)控、翻譯后修飾和細(xì)胞凋亡等多個(gè)生物學(xué)過程。一些消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的疾病伴有SET表達(dá)或亞細(xì)胞定位異常，提示SET與這些疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)TCE可以誘發(fā)SET在L-02細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，沉默SET的表達(dá)可以降低由TCE引起的肝細(xì)胞毒性，證明SET在TCE誘導(dǎo)的肝毒性作用中扮演重要角色。我們通過串聯(lián)親和純化和質(zhì)譜鑒定方法分析SET的相互作用蛋白，在SET復(fù)合物中鑒定出eEF1A1、eEF1A2及DDB1，生物信息學(xué)分析進(jìn)一步證明了eEF1A1、eEF1A2、DDB1和SET的相互作用。我們還進(jìn)一步證明了TCE暴露可以誘發(fā)SET相互作用蛋白eEF1A1和eEF1A2的亞細(xì)胞定位及表達(dá)水平發(fā)生明顯改變［8］。

mRNA在蛋白轉(zhuǎn)錄過程起到非常關(guān)鍵的作用，因此研究mRNA的表達(dá)水平，對進(jìn)一步理解TCE誘導(dǎo)蛋白表達(dá)水平的改變具有重要的意義。針對前期研究結(jié)果，在已經(jīng)研究了TCE對L-02肝細(xì)胞中eEF1A1、 eEF1A2和DDB1蛋白表達(dá)水平的影響基礎(chǔ)上，我們主要探索TCE對eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達(dá)水平的影響。在本實(shí)驗(yàn)中，通過研究不同濃度TCE對eEF1A1、 eEF1A2和DDB1 mRNA表達(dá)的影響以及分析TCE對L-02細(xì)胞的增殖毒性作用，我們發(fā)現(xiàn)，TCE暴露處理L-02細(xì)胞后可明顯影響eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA的表達(dá)并且細(xì)胞活性發(fā)生顯著變化。其中，L-02經(jīng)過1.0 mmol/L TCE暴露后，DDB1 mRNA的表達(dá)水平顯著增高，而經(jīng)（2.0、4.0和8.0mmol/L）TCE處理后，表達(dá)水平呈下降趨勢。DDB1蛋白廣泛參與細(xì)胞周期調(diào)控、組織器官發(fā)育分化、DNA復(fù)制、DNA損傷與修復(fù)以及基因表達(dá)的表現(xiàn)遺傳調(diào)控等重要的生命活動［9］。因此推斷可能是因低濃度TCE染毒L-02后，啟動修復(fù)保護(hù)機(jī)制，DDB1 mRNA表達(dá)水平升高。但是隨著TCE濃度的升高，喪失其保護(hù)機(jī)制，mRNA表達(dá)水平降低。eEF1A1 mRNA的表達(dá)水平隨著TCE濃度的升高呈上升趨勢。eEF1A2 mRNA表達(dá)水平與TCE處理24 h后細(xì)胞活性的變化趨勢接近，即1.0 mmol/L TCE處理，表達(dá)水平上調(diào)，2.0、4.0 和8.0 mmol/L TCE處理，表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢。大量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究已表明，eEF1A可與細(xì)胞內(nèi)許多分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)重要生理過程和機(jī)制。eEF1A1具有促進(jìn)凋亡的作用，而eEF1A2則具有抗凋亡的活性［10］。eEF1A2 mRNA表達(dá)情況可能是由于低濃度TCE暴露處理對細(xì)胞產(chǎn)生凋亡作用，而eEF1A2具有抗凋亡作用，導(dǎo)致其mRNA表達(dá)水平上升，但隨著TCE濃度的增加，其抗凋亡的補(bǔ)償機(jī)制會逐漸減弱，致使其mRNA表達(dá)水平下降。而eEF1A1 mRNA表達(dá)水平的升高則可能是細(xì)胞為對抗TCE產(chǎn)生的毒性作用，通過提高eEF1A2 mRNA的表達(dá)水平對損傷進(jìn)行調(diào)節(jié)修復(fù)。

本研究結(jié)果觀察到TCE處理后可以引起SET及其相關(guān)蛋白eEF1A1、eEF1A2和DDB1在mRNA表達(dá)水平的異常。且SET缺陷可以有效減緩TCE對L-02細(xì)胞的毒性作用，以及對細(xì)胞周期與凋亡的影響［7］。 然而，eEF1A1、 eEF1A2和DDB1如果通過改變表達(dá)水平參與到由SET介導(dǎo)的TCE的毒性作用，需要在后續(xù)工作中通過觀察SET缺陷細(xì)胞株中，TCE染毒下生物學(xué)效應(yīng)及這些基因在表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步明確TCE毒性作用與SET和SET相關(guān)蛋白的內(nèi)在聯(lián)系。

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Effects of trichloroethylene on mRNA expression of SET-associated proteins including eEF1A1，eEF1A2 and DDB1in L-02 cells

HUANG Aibo1，2，HONG Wenxu3，YE Jinbo2，LIU Jianjun2，XU Hua1，*
（1. College of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632；2. Key Laboratory of Modern Toxicology of Shenzhen， Shenzhen Center for Disease Control and Prevention， Shenzhen 518055；3. Shenzhen Research Institute of Population and Family Planning， Shenzhen 518040， Guangdong， China）

目的： 探討人L-02肝細(xì)胞經(jīng)三氯乙烯（TCE）染毒后SET相互作用蛋白eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達(dá)水平的變化。方法：取對數(shù)生長期的L-02肝細(xì)胞，暴露于不同濃度TCE（1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L）中，以DMSO為溶劑對照。24 h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與對照組相比，不同濃度的TCE均能夠使L-02肝細(xì)胞eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達(dá)水平發(fā)生明顯變化。其中，DDB1和eEF1A2 mRNA表達(dá)水平在低濃度（1.0 mmol/L）TCE暴露下顯著升高，而隨著TCE濃度的升高其mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。eEF1A1 mRNA表達(dá)水平隨著TCE濃度的增加而升高（P＜0.05）。結(jié)論：TCE染毒可誘發(fā)L-02肝細(xì)胞中SET相互作用蛋白的mRNA表達(dá)水平發(fā)生改變。

三氯乙烯；細(xì)胞毒性；SET相互作用蛋白；mRNA

OBJECTIVE:To research the effects of trichloroethylene on the RNA expressions of SET-associated proteins including eEF1A1，eEF1A2 and DDB1 in L-02 cells.METHODS：L-02 cells，being in the logarithmic growth phase，were treated with different concentrations （1.0，2.0，4.0，8.0 mmol/L） of trichloroethylene for 24 h， and DMSO were used as control. The mRNA levels of eEF1A1， eEF1A2 and DDB1 were analyzed with qPCR.RESULTS：The results showed that mRNA levels of DDB1 and eEF1A2 were significantly up-regulated under low concentration of trichloroethylene（1.0 mmol/L） and were significantly down-regulated with increasing concentrations of trichloroethylene. The mRNA levels of eEF1A1 were significantly up-regulated with increasing of trichloroethylene concentration.CONCLUSION：Exposure of trichloroethylene c ould a lter m RNA e xpression o f S ET-associated p roteins i n L -02c ells.

trichloroethylene；cytotoxicity；SET-associated proteins；mRNA

R994.6

A

1004-616X（2015）01-0064-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.014

2014-05-28；

2014-10-29

國家自然科學(xué)基金（21102094）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（A2014659 ）； 深圳市科技研究計(jì)劃項(xiàng)目（JCYJ20130329161137543，GJH20120628151305456）；深圳市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提升項(xiàng)目（ZDSY2012061508 580488 9）

作者信息：黃愛博，E-mail：huangaibo@163.com。*通信作者，許 華， Email：h uax_mail@126.com