龍 子，孔德欽，海春旭，*，王 欣，*

（1. 第 四軍醫(yī)大學學員一旅四營十三連，陜西 西安 710032；2. 第 四軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學院毒理學教研室，陜西省自由基生物學與醫(yī)學重點實驗室，陜西 西安 710032）

光氣中毒致肺泡上皮細胞線粒體結構和功能損傷的研究

龍 子1，孔德欽2，海春旭2，*，王 欣2，*

（1. 第 四軍醫(yī)大學學員一旅四營十三連，陜西 西安 710032；2. 第 四軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學院毒理學教研室，陜西省自由基生物學與醫(yī)學重點實驗室，陜西 西安 710032）

光氣作為一種無色窒息性化學毒劑，又名碳酰氯或二氯碳酰，分子式為COCl2，是重要的軍用化學戰(zhàn)劑［1］。 光氣也是一些化工產(chǎn)品合成的重要原料，廣泛用于農藥、制藥、塑料、涂料、染料及紡織品等生產(chǎn)領域中。由于其揮發(fā)溫度低（7.9 ℃）、反應快速、分散度高等特點，在生產(chǎn)、運輸、管理過程中會出現(xiàn)意外泄漏，如若防護不當，?？蓪е氯藛T中毒及傷亡的嚴重公共事件。肺臟是光氣攻擊損害的主要靶器官，大劑量光氣中毒可造成動物急性肺損傷、肺水腫，嚴重時發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征，導致光氣中毒死亡［2-4］。線粒體是細胞內的一種非常重要的細胞器，在能量代謝和信號通路傳導等方面發(fā)揮重要作用［5-6］。本研究中我們通過構建光氣中毒大鼠模型，探討光氣中毒對線粒體的結構和功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，動物合格證號SCXK（軍）2013-0008。光氣由本教研室化學方法（40%固體三光氣溶于環(huán)已烷，二甲基甲酰胺滴定產(chǎn)生）制備。BCA蛋白檢測試劑盒購自美國Pierce公司。戊巴比妥鈉、NADH、牛血清白蛋白（BSA）和三磷酸腺苷（ATP）等購自Sigma公司。其他常規(guī)試劑為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及染毒方法 30只SD大鼠（SPF級），雄性，6～8周齡，體質量180～220 g，隨機分為正常對照組和染毒組，每組15只。正常對照組以空氣為對照。根據(jù)課題組以往的研究基礎［7-8］，染毒組給予光氣動態(tài)染毒（10 g/m3），染毒5 min，構建光氣致急性肺損傷模型。動物于染毒后2 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，處死全部大鼠，分別采集樣本進行檢測。將其中6只大鼠的整個肺離體后立即稱濕重，80 ℃烘干48 h后稱干重，計算濕/干比。

1.2.2 HE染色檢測 取余下9只大鼠的左肺上葉，漂浮固定于10%中性緩沖福爾馬林液中48 h后常規(guī)脫水、透明、包埋，在Leica RM2135型輪轉式切片機上制備4μm切片，進行HE染色。

1.2.3 透射電鏡觀察 取9只大鼠左肺下葉，組織塊約1 mm3大小，加入3%戊二醛4 ℃固定3 h，交由電鏡室制作透射電鏡標本。鏡下觀察、拍照，重點觀察線粒體微觀改變。電鏡下對肺泡上皮細胞線粒體進行半定量分析。相同放大倍數(shù)下隨機選擇5個視野照相，每個視野中隨機選取約20個線粒體進行分析。每只動物對100個線粒體進行分析。按照線粒體的受損程度，逐個將線粒體進行0～4級記分（級別越高損傷程度越重），最后計算平均分數(shù)。

評分標準：0分為正常；1分為結構基本正常，基質顆粒丟失（輕度腫脹，基質密度減少，嵴分離）；2分為線粒體腫脹（基質密度嚴重減小，嵴分離），基質透明，嵴未斷裂；3分為線粒體嵴斷裂，基質凝固（嚴重腫脹）；4分為內外膜完整消失，呈空泡狀（嚴重腫脹伴嵴斷裂，內外膜破裂）。

1.2.4 制備肺臟組織線粒體懸液 采用改良的分離介質，迅速取出9只大鼠的右肺組織，按1∶9（m/V）加入帶有冰渣的分離介質（0.25 mol/L蔗糖，0.05 mol/L甘露醇，1 mmol/L 乙二胺四乙酸，10 mmol/L 氨基丁醇，pH 7.5），電動勻漿器勻漿（5 000 r/min離心1 min），制成10%的肺組織勻漿液。然后將勻漿液于600 r/min低速離心10 min，取上清；再以1 600 r/min離心5min，取上清；最后12 500 r/min離心10 min，留沉淀，即為線粒體；沉淀用分離介質5 mL再次懸浮，12 500r/min離心10 min后得到的沉淀為提純的線粒體。往沉淀中加入1 mL分離介質制成線粒體懸液，用BCA法測定蛋白含量。

1.2.5 線粒體呼吸鏈復合酶活力測定 所有測定均在25 ℃條件下進行，用酶促一級反應的初速度來計算酶活力［9］。①復合物I的測定：在樣品杯中加入0.2mol/L，pH7.4的PBS 1.5 mL，10 mmol/L鐵氰化鉀0.3mL，線粒體懸浮液0.03 mL，0.1 mol/L氰化鉀0.05mL，用雙蒸水補充體積至2.97 mL，加入0.1 mol/L NADH （用10 mmol/L Tris配制） 30 μL作為起動劑，在420 nm波長處進行檢測?？瞻妆杏猛w積分離介質代替線粒體懸浮液，不加NADH，其余加入試劑均同樣品杯。單位定義：每毫克線粒體蛋白每分鐘消耗的NADH的物質的量。氧化型輔酶I的克分子消光系數(shù)E420=1.033 mmol/（L·cm）。②復合物II的測定：根據(jù)2，6-二氯酚靛酚鈉鹽在600 n m處吸光度的減少進行測定。肺組織勻漿懸于25 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH7.5）中，分別在不同濃度的琥珀酸鹽、加入艾地苯醌或吩嗪硫酸甲酯作為電子受體、不同濃度的艾地苯醌、加入或不加常用的佐劑——BSA和ATP這4種條件下進行測定。從加入艾地苯醌反應開始進行，3 min內吸光度持續(xù)下降，復合物II活性的特異性通過加入特異性抑制劑丙二酸（5 mmol/L） 或 2-噻吩甲酰三氟丙酮（500μmol/L） 后的抑制率來測量。③復合物 II+III的測定：在樣品杯中加入0.2 mol/L， pH7.4的PBS 1.5 mL，3mmol/L EDTA-K 0.3 mL，0.1 mmol/L氧化型細胞色素C（cytC） 0.1 mL，0.1 mol/L氰化鉀0.05 mL，線粒體懸浮液0.03 mL，用雙蒸水補充體積至2.97 mL，加入0.1mol/L NADH （用10 mmol/L Tris配制） 30 μL作為起動劑，在550 nm波長處進行檢測，空白杯中用同體積分離介質代替線粒體懸浮液，除不加NADH外其余加入試劑均同樣品杯，單位定義：每毫克線粒體蛋白每分鐘還原cytC的物質的量。復合物II+III的活性減去復合物II的活性，即得復合物III的活性。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 光氣染毒后肺濕/干比值的變化

光氣染毒2 h后，與陰性對照組相比，光氣染毒組大鼠的肺濕/干比值明顯升高（P＜0.01），見圖1。

2.2 光鏡下肺臟HE染色觀察

肺組織HE染色檢查結果如圖2。陰性對照組大鼠細支氣管結構和肺臟未見異常。肺泡腔中無紅細胞滲出，肺泡腔與肺泡隔完整（圖2A）。與對照組相比，光氣染毒后，大鼠肺泡腔可見大片出血樣改變，大量紅細胞和炎性細胞聚集于肺泡壁周圍，肺泡壁增厚，肺泡壁邊緣不規(guī)整，肺泡腔有明顯的滲出物樣物質，血管內有許多凝聚的細胞（圖2B）。

2.3 肺組織超微結構觀察

光氣染毒后，透射電鏡觀察結果顯示：正常對照組，Ⅱ型肺泡上皮細胞結構完整，線粒體輪廓正常，基質密度致密、均勻；線粒體嵴完整，內質網(wǎng)排列有序（圖3A和B）。I型肺泡上皮細胞表面光滑、氣血屏障結構完整，內皮結構正常，肺泡腔未見明顯的紅細胞和滲出物（圖3C和D）。正常對照組線粒體損傷評分為0分。

光氣染毒組肺Ⅰ型細胞表面不完整，基質出現(xiàn)大小不等的空泡，細胞核邊集，出現(xiàn)凋亡樣改變（圖4A）。肺Ⅱ型細胞核邊集，線粒體變少，形態(tài)發(fā)生改變，細胞內出現(xiàn)滲出物。部分線粒體內膜完整性消失，基質透明，多數(shù)線粒體呈空泡狀，嚴重腫脹伴嵴斷裂，內膜破裂，線粒體損傷評分為4分（圖4B和C）。腔內泡狀突起減少（或消失），肺組織充血與水腫明顯，氣血屏障受損，內質網(wǎng)擴張，排列紊亂（圖4D）。腔內可見大量纖維狀滲出物，氣血屏障受損（圖4E）。線粒體嚴重腫脹、嵴斷裂，部分呈現(xiàn)空泡狀，排列紊亂，基質凝固，線粒體損傷評分為4分，同時，板層小體呈巨大空泡樣變化（3分）（圖4F）。染毒組肺組織線粒體損傷評分為（3.7±0.5）分。

2.4 線粒體復合物活性

在光氣染毒2 h后，測定肺組織線粒體氧化呼吸鏈酶復合物的活性，反映細胞的呼吸鏈功能發(fā)生的變化。與陰性對照組相比，光氣染毒組線粒體復合物Ⅰ、復合物Ⅱ和復合物Ⅲ活性均明顯降低（P＜0.05）。見圖5。

3 討 論

光氣是一種窒息性劇毒氣體，吸入后主要通過導致肺水腫引起中毒。目前，光氣導致肺水腫的機制還不完全清楚［10］，其中毒主要有以下幾個特點：①毒性作用特別強，往往能夠引起嚴重的急性呼吸道損傷，特別是導致肺水腫，造成急性呼吸窘迫綜合征［11］；②反應速度特別快，在很短的時間內產(chǎn)生毒性，一般不具有遺傳毒性和致癌性；③分散度較高，使其在空氣中漂浮時間較長，導致接觸暴露的機會增加，發(fā)生中毒的概率增加；④軍民兩用，光氣作為化工原料、產(chǎn)品或副產(chǎn)物廣泛存在于生活和生產(chǎn)中，突發(fā)事故或恐怖活動都可以導致光氣中毒［12］；⑤防治困難，目前光氣中毒還缺乏有效的救治藥物，迫切需要尋找新的中毒靶點，指導有效藥物的研發(fā)［10］。

本課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)，繼發(fā)氧化損傷在光氣中毒中發(fā)揮重要作用［13］。線粒體是細胞內的一種非常重要的細胞器，在能量代謝和信號通路傳導等方面發(fā)揮重要作用。線粒體是細胞內活性氧生成的主要部位，也是氧化損傷的主要靶點［14］。本文重點研究了光氣對線粒體結構和功能的影響。研究發(fā)現(xiàn)，光氣染毒后，不僅存在炎細胞浸潤，更重要的是肺Ⅰ型、Ⅱ型上皮細胞受到破壞損傷，透射電鏡檢測可以看到，線粒體明顯腫脹，形態(tài)改變，甚至固縮溶解，數(shù)量減少，線粒體嵴斷裂和缺失；線粒體復合物受損，活性降低，表明光氣中毒后的毒性作用靶點是線粒體，出現(xiàn)了線粒體結構和功能異常。本課題組以往研究已發(fā)現(xiàn)，光氣中毒可以導致線粒體ATP酶活性降低［15］。綜上所述，光氣導致線粒體結構和功能受損，引起ATP合成障礙，細胞的穩(wěn)定性、順應性降低，嚴重破壞細胞的修復功能，如不能及時阻斷，就會不可逆轉地導致動物肺組織壞死，失去功能。本實驗結果表明，肺泡上皮細胞線粒體損傷為光氣中毒損傷的主要毒作用靶點，為光氣中毒防治提供了新思路。

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Study on phosgene-induced damage of pulmonary mitochondria

LONG Zi1，KONG Deqin2，HAI Chunxu2，*，WANG Xin2，*
（1. The Thirteenth Company， the Fourth Battalion， First Brigade，F(xiàn)ourth Military Medical University， Xi’an 710032； 2. Shaanxi Key Lab of Free Radical Biology and Medicine， Department of Toxicology， School of Preventive Medicine， Fourth Military Medical University， Xi’an 710032， Shaanxi， China）

目的： 研究光氣中毒對肺泡上皮細胞線粒體結構和功能的損傷作用。方法：30只SD大鼠隨機分為正常對照組和染毒組，每組各15只。正常對照組以空氣為對照。染毒組給予光氣（10 g/m3）動態(tài)染毒5 min，構建光氣致急性肺損傷模型。染毒后2 h麻醉，采集肺組織樣本，測定肺組織濕/干比，進行肺組織病理檢測和電鏡觀察，并測定肺組織線粒體酶復合物活性。結果：與對照組比較，光氣染毒后，肺濕/干比顯著增加（P＜0.01），肺組織存在炎細胞浸潤和肺泡上皮細胞損傷；線粒體明顯腫脹，形態(tài)改變，甚至固縮溶解，數(shù)量減少，線粒體嵴斷裂和缺失，線粒體酶復合體活性降低（P＜0.05）。結論：肺泡上皮細胞線粒體損傷為光氣中毒的主要毒作用靶點之一，本研究結果為光氣中毒防治提供了新思路。

光氣；急性肺損傷；線粒體；中毒

OBJECTIVE:To study the toxicological effects of phosgene on pulmonary mitochondria.METHODS：30 SD rats were randomly divided into two groups，with 15 in each group. The rats in control group were exposed to air. The rats in phosgene group were exposed to 10 g/m3phosgene for 5 min. Two hours after exposure，pulmonary tissues were collected，HE staining and transmission electron microscope were used to identify histological changes. Activities of mitochondrial complexes were determined.RESULTS：Phosgene induced a significant increase of pulmonary wet/dry ratio. After phosgene poisoning，there were profuse neutrophil infiltration and pulmonary alveoli epithelial cell damage. Mitochondria were notably swollen，and even appeared contracted and dissolved. The number of mitochondria was significantly decreased. Mitochondrial ridge was broken and absent. The activities of mitochondrial complex were significantly reduced.CONCLUSION：Mitochondria were main targets of phosgene poisoning，and the results provided basis for the development of new drugs in the treatment of phosgene poisoning.

phosgene；acute lung damage；mitochondria；poisoning

R994.7

A

1004-616X（2015）01-0054-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.012

2014-10-03；

2014-12-25

軍隊青年基金資助（13QNP124）

作者信息：龍 子，E-mail：zi_long11@163.com。*通信作者：海春旭，E-mail：Cx_hai@fmmu.edu.cn；王 欣，E-mail：x inwang@fmmu.edu.cn